[发明专利]一种发酵培养基及利用其生产黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的方法

权利要求书

1.一种用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的发酵培养基ITB，每1L培养基含：酪蛋白胨10-14g，酵母提取物16-20g，甘油2.4-4mL，NH₄Cl0.75-1g，0.17mol/L KH₂PO₄和0.72mol/L K₂HPO₄混合溶液75-100mL，MgSO₄0.168-0.216g，微量元素0.75-1mL。

2.根据权利要求1所述的发酵培养基ITB，其特征在于，每1L培养基含：酪蛋白胨12g，酵母提取物16.61g，甘油3.05mL，NH₄Cl1g，0.17mol/L KH₂PO₄和0.72mol/L K₂HPO₄混合溶液100mL，MgSO₄0.185g，微量元素1mL。

3.根据权利要求1或2所述发酵培养基ITB，其特征在于，微量元素包括：FeCl₃·6H₂O27g/L、ZnCl₂2g/L、CoCl₂·6H₂O2g/L、Na₂MoO₄·2H₂O2g/L、CaCl₂·2H₂O1g/L，或无水CaCl₂0.76g/L、CuCl₂·2H₂O1.27g/L、H₃BO₃0.5g/L，溶于1.2mol/L HCl。

4.根据权利要求1或2或3所述的发酵培养基ITB，其特征在于：K₂HPO₄和KH₂PO₄混合溶液的配制方法为：用90mL去离子水溶解2.31g KH₂PO₄和12.54g K₂HPO₄，完全溶解后，用去离子水定容至100mL。

5.一种黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的生产方法，是复苏工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA工作种子，按体积比1:100比例接种于5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时，按照1:100再转接于100mL的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12小时左右，得到种子液；

将种子液按体积比1:100的量接种于含3L权利要求1或2或3或4所述发酵培养基ITB的5L发酵罐内，pH值控制在7.0±0.1，培养温度为37℃，溶解氧控制在30％左右，发酵培养6h；之后按照1mL/min的流速补加发酵培养基ITB，总共补加500mL，发酵15小时后，结束发酵，收菌，提取质粒，得到黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA。

6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于：所述工程菌E.coli XL10-Gold/CAVA，是将黑色素瘤治疗性pSVK-CAVA质粒DNA转化大肠杆菌XL10-Gold得到转化菌XL10-Gold；再将转化菌XL10-Gold涂布于LB固体平板培养基，在37℃、200rpm下培养15小时后挑取单克隆菌落；将单克隆菌落接种于5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时后按照1:100进行连续传代培养，12小时转接传代1次，可连续传代30代；单克隆菌株以及传代30代以内历次传代菌株均为转化大肠杆菌XL10-Gold的工程菌。