[发明专利]焦糖色素中副产物4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种焦糖色中副产物4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑的检测方法，属于食品安全检测的检验方法。 

背景技术

4-甲基咪唑(4-Methylimidazole，4-MEI)是III和IV类焦糖色生产加工过程中美拉德反应(Maillard browning model systems)产生的一种副产物，有研究显示，其能够诱发肿瘤。欧洲食品安全局(EFSA)报道称，III类焦糖色在生产加工过程中还会产生2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑(2-acetyl-4-tetrahydroxy-butylimidazole，THI)，该物质具有免疫毒性。 

目前，对焦糖色素中4-MEI含量的测定，我国唯有食品添加剂焦糖色国家标准GB8817-2001，焦糖色素中THI的测定没有国家标准。国际上，世界粮农组织/WTO食品添加剂联合专家委员会(JECFA)焦糖色质量规格JECFA-2011中4-MEI和THI分别采用气相色谱和液相色谱的衍生化方法分别检测。根据文献检索，现有的焦糖色素中副产物4-MEI和THI的测定方法大约有以下几种：薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、离子色谱法、毛细管电泳法、气-质联用技术、液-质联用技术。其中前几种技术大都需要较复杂的前处理技术，这对于大量的样品分析是十分不利的。液相色谱法紫外检测器可同时检测两种物质，由于灵敏度的限制，如此复杂的样品基质相对较大的取样量对前处理技术的要求非常高。因此，当前迫切需要建立能够快速准确测定焦糖色中副产物4-MEI和THI的检测方法。 

发明内容

1.本发明的目的在于提供一种焦糖色中副产物4-MEI和THI同时检测的方法，该方法包括如下步骤：(1)待测样品溶液的制备；(2)样品检测；和(3)结果分析。 

(1)待测样品溶液的制备包括如下具体步骤： 

(a)制备固相萃取上样溶液：称取焦糖色素样品1g(准确至0.001g)，置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度。取0.1mL上述样品溶液，加入0.1mL盐酸溶液(0.02moL/L)，加入0.2mL内标溶液D6-4-甲基咪唑(D6-4-Methylimidazole，D6-4-MEI，1.0μg/mL)，加水定容至2mL，混匀后待同相萃取净化。 

(b)固相萃取柱活化：选择混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60mg、3mL，使用前依次用2mL甲醇、2mL水活化。 

(c)固相萃取：将(a)制备好的样品溶液加入(b)中刚活化好的小柱中，控制流速小于0.5mL/min，抽干，加入1mL水和1mL甲醇淋洗，控制流速小于1.0mL/min，抽干，用洗脱液(氨水+甲醇＝5+95(v/v))2mL洗脱收集，控制流速小于0.5mL/min，抽干。将收集液在低于50℃条件下，氮气吹干， 残渣用0.5mL溶液(氨水+乙腈+水＝0.05+5+94.95(v/v))定容，涡旋混合1min，过0.22μm水系微孔滤膜，即制得待测样品溶液，内标法定量。 

本发明的实施方案中，步骤(a)中称量1g样品定容到100mL水中，取0.1～0.2mL样品溶液准备固相萃取，优选0.1mL，上样溶液加水定容至2～3mL，优选2mL。 

本发明的实施方案中，步骤(c)中1～2mL水和1～2mL甲醇淋洗，优选1mL水和1mL甲醇淋洗，优选2mL洗脱液洗脱。收集液可以在低于50℃条件下吹干或者旋转浓缩挥干，残渣加入定容溶液后需要涡旋1min或者超声波30秒溶解并过0.22μm水系微孔滤膜。 

(2)样品检测包括如下具体步骤： 

(a)标准品溶液的制备：分别准确称取4-MEI、THI和D6-4-MEI标准品，用水溶解，分别配成0.5mg/mL的储备溶液，使用时，用水稀释成标准使用溶液。 

(b)用液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)仪，配有电喷雾离子源(ESI)测定待测样品溶液和标准品溶液。仪器参考条件如下： 

液相色谱条件 

色谱柱：Polaris C18-A柱(2.1mm×150mm，3μm)。 

流动相：A为0.05％氨水溶液；B为乙腈。梯度洗脱条件见表1 

柱温：30℃ 

进样量：10μL 

流速：0.4mL/min 

表1液相梯度洗脱条件 

质谱检测器条件： 

电离方式：H-ESI电离，正离子 

离子喷雾电压：正离子4000v