[发明专利]焦糖色素中副产物4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑的检测方法

权利要求书

1.一种焦糖色中副产物4-甲基咪唑和2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑的检测方法，该方法包括如下步骤：(1)待测样品溶液的制备；(2)样品检测；和(3)结果分析。其特征在于，其中步骤(1)待测样品溶液的制备包括如下具体步骤：

(a)制备固相萃取上样溶液：称取焦糖色素样品1g(准确至0.001g)，置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度。取0.1mL上述样品溶液，加入0.1mL盐酸溶液(0.02moL/L)，加入0.2mL内标溶液(D6-4-MEI，1.0μg/mL)，加水定容至2mL，混匀后待固相萃取净化。

(b)固相萃取柱活化：选择混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60mg、3mL。使用前依次用2mL甲醇、2mL水活化。

(c)固相萃取：将(a)制备好的样品溶液加入(b)中刚活化好的小柱中，控制流速小于0.5mL/min，抽干，加入1mL水和1mL甲醇淋洗，控制流速小于1.0mL/min，抽干，用洗脱液(氨水+甲醇＝5+95(v/v))2mL洗脱收集，控制流速小于0.5mL/min，抽干。将收集液在低于50℃条件下，氮气吹干，残渣用0.5mL溶液(氨水+乙腈+水＝0.05+5+94.5(v/v))定容，涡旋混合1min，过0.22μm水系微孔滤膜，即制得待测样品溶液，内标法定量。

步骤(2)样品检测包括如下具体步骤：

(a)标准品溶液的制备：分别准确称取4-甲基咪唑(4-Methylimidazole，4-MEI)、2-乙酰基-4-羟基-丁基咪唑(2-acetyl-4-tetrahydroxy-butylimidazole，THI)和D6-4-甲基咪唑(D6-4-Methylimidazole，D6-4-MEI)标准品，用水溶解，分别配成0.5mg/mL的储备溶液，使用时，用水稀释成标准使用溶液。

(b)用液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)仪，配有电喷雾离子源(ESI)测定待测样品溶液和标准品溶液。仪器参考条件如下：

液相色谱条件

色谱柱：Polaris C18-A柱(2.1mm×150mm，3μm)。

流动相：A为0.05％氨水溶液；B为乙腈。梯度洗脱条件见表1

柱温：30℃

进样量：10μL

流速：0.4mL/min

表1液相梯度洗脱条件

质谱检测器条件：

电离方式：H-ESI电离，正离子

离子喷雾电压：正离子4000v

挥发气温度：400℃

毛细管温度：270℃

鞘气：60Arb

辅助气：15Arb

碰撞气：氩气

扫描模式：多反应监测(MRM)，各离子参数详见表2

表2多反应监测(MRM)

测定定量子离子峰面积，D6-4-MEI为内标，然后分别作4-MEI(THI)与内标的峰面积比-4-MEI(THI)浓度(ng/mL)标准曲线，曲线方程见式(1)：

y＝ax+b         ………(1)

式中：x——4-MEI或THI峰面积与内标物质D6-4-MEI峰面积的比值；

y——4-MEI或THI的浓度，单位为钠克每毫升(ng/mL)。

步骤(3)结果分析包括如下具体步骤：

(a)试样溶液的测定：待测试样溶液中4-MEI或THI的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。

(b)定性判定：按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致(变化范围在±2.5％之内)；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断样品中存在目标化合物4-MEI或THI。

表3定性离子相对丰度的最大允许偏差

(c)分析结果的表述：

试样中4-MEI(THI)含量按公式(2)计算：

X=(C-C0)×V×103m×106...(2)]]>

式中：

X——试样中4-MEI或THI的含量，单位为克每千克(mg/kg)；

C——由标准曲线查得试样进样液中4-MEI或THI的浓度，单位为钠克每毫升(ng/mL)；

C₀——由标准曲线查得空白试样进样液中4-MEI或THI的浓度，单位为钠克每毫升(ng/mL)；

V——试样制备液总体积，单位为毫升(mL)；

m——试样质量，单位为克(g)；

结果保留三位有效数字。