[发明专利]活性污泥中总DNA的冻融改良式提取方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于环境科学领域，特别涉及一种活性污泥中总DNA的冻融改良式提取方法及其应用。

背景技术

从天然的岩石下面采出的油水混合物经过油水分离后产生的水就叫采油废水。采油废水中含有许多有机和无机物，而且不同的油田所处的地理位置，地质结构，油田的开采寿命，开采石油烃的种类不同，所产生的采油废水的种类也不同。另外，由于钻井污水、洗井污水、生活污水等污水的混入，使得采油废水的成分更加复杂。通常情况下，采油废水有以下特点：(1)含油量高。通常采油废水中的原油含量可达1000-2000mg/L，部分油田的废水中的含油量甚至可达5000mg/L以上。依据含油颗粒在废水中的粒径可将其分为浮油、分散油、乳化油和溶解油。粒径大于100μm的浮油和10-100μm 的分散油占废水中总含油量的90%左右，0.1-10μm的乳化油占10%，小于0.1μm的溶解油含量很低。(2)含盐量高。油田采油污水所含的盐主要是无机盐，一般不同的油田甚至不同区块、油层的含盐量都不同，从几千到十几万毫克升不等。所含的无机盐离子主要包括：Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺、Na⁺、Fe²⁺、Cl⁻、SO₄²⁻、HCO₃⁻和CO₃²⁻等。(3)含悬浮固体颗粒。一般是1-100μm的颗粒，主要包括粘土颗粒、粉砂和细砂等。(4)含细菌。一般以腐生菌和硫酸盐还原菌居多。(5)有些还含表面活性剂。此外，采油废水还有高温(40-80℃)和高pH值的特点。

采油废水的处理可采用物理法、化学法、生物法、膜法及其相结合的方法。在这些处理方法中生物处理法因其运行费用低，操作简便等特点而被广泛的应用。通常对采油废水处理的生物处理法可分为：活性污泥法、生物膜法、生物接触氧化池、氧化塘等。活性污泥法是在处理可生物降解的污水中最常见的技术，该方法对废水的处理可分为生物和物理两个阶段，在生物阶段主要是活性污泥中的微生物降解废水中的有机物、铵盐和磷酸盐等物质。在该技术中对处理效果起关键性作用的就是活性污泥中微生物的活性，而微生物的活性又由活性污泥中微生物的群落结构和特征所决定。活性污泥中的微生物群落很丰富，主要由细菌、真菌、古菌、放线菌、藻类、原生动物和后生动物等构成，其中最主要的是细菌，大约占整个活性污泥微生物群落的95%。因此，细菌是活性污泥废水处理系统中有机物、铵盐和磷酸盐等物质有效去除的重要保障。然而，对细菌的菌种鉴定、筛选和基因工程菌的合成中，DNA的高效提取为其关键技术，因此，国内外大量学者开展DNA提取方法研究。采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）+梯度反复冻融法+溶菌酶+蛋白酶法开展菌种DNA提取研究，利于分析采油废水处理系统活性污泥中细菌、真菌在种类和数量上的变化。研究结果可为后续活性污泥筛选高效除油菌株、构建高效除油复合菌群提供理论依据，同时对指导实际生产运行具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种活性污泥中总DNA的冻融改良式提取方法及其应用。

本发明的思路：充分利用梯度反复冻融法的优势，改良“CTAB+冻融+溶菌酶+蛋白酶法”DNA提取法，并应用到高盐度采油废水生物处理系统的活性污泥DNA的高效提取中。

本发明的机理：利用CTAB对传统DNA提取缓冲液进行改良，利用梯度冷冻并溶出的方法有效分离所需DNA片段，再应用溶菌酶和蛋白酶法完成高盐度采油废水净化系统中活性污泥的DNA高效提取。

具体步骤为：

(1)均匀取得目标DNA来源体污泥20~30mL，其含水率大于98%，置于100mL离心管中，以6000~8000r/min的转速进行离心预处理5~8min，弃去上清液，过快速滤纸收集沉淀物质待用，所收集的沉淀物质小于1mL。

(2)将步骤(1)所收集的沉淀物质加入到2mL的具塞离心管中，并加入1~2mL的DNA提取缓冲液，漩涡振荡器振荡5~10min后待用；所述DNA提取缓冲液含有100~150mmol/L的EDTA、100~150mmol/L的Tris-HCl、1.5~3.0mol/L的NaCl、质量百分比浓度为2~5% 的CTAB和质量百分比浓度为1~3% 的PVPP，并使用0.1~0.5mol/L的HCl和NaOH稀溶液调节DNA提取缓冲液的pH值至8.0。