[发明专利]活性污泥中总DNA的冻融改良式提取方法及其应用

权利要求书

1.一种活性污泥中总DNA的冻融改良式提取方法，其特征在于具体步骤为：

(1)均匀取得目标DNA来源体污泥20~30mL，其含水率大于98%，置于100mL离心管中，以6000~8000r/min的转速进行离心预处理5~8min，弃去上清液，过快速滤纸收集沉淀物质待用，所收集的沉淀物质小于1mL；

(2)将步骤(1)所收集的沉淀物质加入到2mL的具塞离心管中，并加入1~2mL的DNA提取缓冲液，漩涡振荡器振荡5~10min后待用；所述DNA提取缓冲液含有100~150mmol/L的EDTA、100~150mmol/L的Tris-HCl、1.5~3.0mol/L的NaCl、质量百分比浓度为2~5%的CTAB和质量百分比浓度为1~3%的PVPP，并使用0.1~0.5mol/L的HCl和NaOH稀溶液调节DNA提取缓冲液的pH值至8.0；

(3)将步骤(2)制得的物质放入-80℃冰箱中冷冻6~8min，然后放入65℃水浴锅中水浴10~15min，再放入-60℃超低温冰箱冷冻10~15min，然后放入65℃水浴锅中水浴10~15min，接着放入-40℃超低温冰箱冷冻25~30min，然后放入65℃水浴锅中水浴10min；每次冷冻后的水浴期间均要求颠倒混匀1~2次，完成梯度升温冷冻-水浴解冻而制得样品备用；

(4)向步骤(3)制得的样品中加入80~100μL浓度为10mg/mL的溶菌酶，置于37℃水浴中培养10~15min，每隔2~3min上下颠倒混匀一次，然后加入10~15μL浓度为10mg/mL蛋白酶K和150~200μL质量百分比浓度为10%的SDS，65℃水浴10min，然后直接放入-80℃冰箱中速冻6~8min，最后在65℃温水中解冻28~32min；重复本冻融步骤3次，制得样品备用；

(5)将步骤(4)制得的样品在常温下以6000~8000r/min的转速离心10~15min，取上清液分装于2mL的离心管中，加入等体积的体积比为1:1的Tris饱和酚-氯仿混合液，上下颠倒混匀，在8000~10000r/min的转速下离心10~15min，即完成抽提，本抽提步骤重复2次，制得上清液备用；

(6)将步骤(5)制得的上清液转移到1~2mL的离心管中，加入为上清液0.6~0.8倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置1~1.5h，在10000-120000r/min的转速下离心10~15min，弃掉上清液，用预冷的50~70%的乙醇洗涤沉淀2~3次，在8000~10000r/min的转速下离心2~5min，用无水乙醇连续漂洗2次，弃上清液后，室温下风干，加入30μL无菌水即制得目标样品，目标样品在-20℃下保存。

2.根据权利要求1所述的活性污泥中总DNA的冻融改良式提取方法的应用，其特征在于该方法应用于高盐度采油废水处理系统活性污泥中总DNA的提取。