[发明专利]一种产甲烷泡菌的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其是涉及一种产甲烷泡菌的快速定量检测方法。

背景技术

产甲烷泡菌(Methanofollis)属于甲烷微菌科(Methanomicrobiaceae)，主要存在于厌氧污泥、油藏等环境中。生长温度为20℃～45℃，革兰氏阴性，大小1.5～3.0μm不规则球形，一般单生，可以利用甲酸、氢气/二氧化碳、乙醇等产生甲烷。目前，已报道的产甲烷泡菌并不多，全部为严格厌氧菌，生长条件苛刻，目前对其生理生长特性也没有完全认识，培养方法也知之甚少，培养难度较大，因此依赖培养的方式还无法对所有的Methanofollis进行系统的定量分析。

在产甲烷泡菌检测分析方面，目前还没有针对性的检测手段，常规方法仅仅是通过16S rRNA基因克隆文库的方法对样品当中含有的产甲烷泡菌首先进行定性分析，定性分析需要在提取样品DNA之后通过PCR扩增、胶回收、连接、转化、挑单菌、测序、得到测序结果并最终通过序列分析等一系列步骤才能完成。就定量分析而言，目前只能通过分子生物学方法确定Methanofollis在样品中的相对含量，并结合样品总菌浓(如生物显微镜计数等)进行计算获得。通常情况下，待测样品一般包含多种微生物，而且不同微生物的丰度相差巨大。在采用传统方法分析时，一方面，生物显微镜计数误差较大，且不能做低浓度检测，另一方面，对于丰度低的产甲烷泡菌可能会出现漏检，对于不同生理特性的产甲烷泡菌，往往因为培养条件不适也会造成漏检，同时，传统方法存在着耗时、过程繁杂等缺陷。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种特异性强，操作便捷、检测准确的产甲烷泡菌的检测方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种产甲烷泡菌的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)提取待测样品中微生物的DNA；

(2)采用特异性引物对，对步骤(1)获得的样品DNA进行荧光定量PCR扩增，读取荧光定量PCR扩增反应的初始循环数；

(3)根据公式：对样品中产甲烷泡菌进行定量，C_T为初始循环数，N为待测样品中产甲烷泡菌(Methanofollis)菌浓。

步骤(2)所述的特异性引物对序列为：

正向：GTCTCACCAGAACGACTC

反向：TAAGTTTCAGCCTTGCGAC。

步骤(2)所述的荧光定量PCR扩增的反应体系组成包括：4μL无菌水，12μL通用SYBR绿色荧光染料混合体系(Universal SYBR Green Master Mix)，25μM的正向和反向特异性引物各1μL，2μL标准样品DNA或待测样品DNA。

步骤(2)所述的荧光定量PCR扩增的程序为将荧光定量PCR扩增的反应体系按以下程序进行反应：a)95℃保温4min；b)94℃保温45s；c)60℃保温30s；d)72℃保温45s；e)重复执行b)～d)65次；f)从65℃开始每5s增加0.5℃至达到95℃为止。

本发明的产甲烷泡菌检测方法中，提取产甲烷泡菌标准样品DNA和待测样品DNA的方法按照公司的细菌组DNA提取试剂盒说明书进行(Axygen生物科技有限公司，美国)。

与现有技术相比，本发明针对现有技术的不足设计了特性性的引物，采用特异性引物结合荧光定量PCR扩增目标DNA的方法，获得培养样品中产甲烷泡菌属的含量，克服了传统技术中的缺陷，本发明方法特异性强，操作便捷、检测准确。

附图说明

图1为标准菌菌浓与初始循环数关系曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。该实施例仅仅是对本发明的举例说明，并不意味着对发明范围的限制。

标准曲线的制作：

取产甲烷泡菌Methanofollis菌液(菌浓4.62×10¹⁰个/mL)，做10倍梯度稀释，分别提取10mL稀释菌液的DNA，溶解到10μL无菌水中，备用。

采用特异性引物(正向：GTCTCACCAGAACGACTC，反向：TAAGTTTCAGCCTTGCGAC)对获得标准样品DNA进行荧光定量PCR扩增，反应体系和反应程序如下：