[发明专利]一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及海洋生物提取技术领域，特别涉及一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法。

背景技术

鳕鱼皮由于其蛋白含量高，故其主要的生物活性成分即为活性肽。现在研究发现，鳕鱼皮生物活性肽具有抗氧化、抗病毒、抗胃溃疡等作用。Dai-Hung Ngo等从太平洋鳕鱼皮中分离纯化两种胶原蛋白肽，Thr-Cys-Ser-Pro (388 Da)和 Thr-Gly-Gly-Gly-Asn-Val (485.5 Da)。通过电子自旋共振法证明了纯化的肽的抗氧化活性， 同时也具有血管紧张素转换酶抑制作用，说明鳕鱼皮胶原蛋白肽具有抗氧化和抗高血压的作用（Dai-Hung Ngoa, BoMi Ryua, Thanh-Sang Voa, et al. Free radical scavenging and angiotensin-I converting enzyme inhibitory peptidesfrom Pacific cod (Gadus macrocephalus) skin gelatin [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 4(9):1110–1116）。宛宁从鳕鱼皮中分离的到一种胶原蛋白肽PGEKGPSGEAGTAGPPGTPGPQGL，该肽能直接作用于病毒颗粒，病毒的凝集价显著降低且成剂量依赖性，具有极强的流感病毒神经氨酸酶抑制活性，活性肽的抗病毒作用具有多靶点（苑宁. 鳕鱼皮中流感病毒神经氨酸酶抑制活性肽的研究[D].青岛:中国海洋大学,2013）。王志聪等探究鳕鱼皮胶原蛋白肽的抗酒精性胃溃疡作用，采用酒精诱导大鼠急性胃溃疡模型，试验组灌胃给予不同剂量的胶原肽，检测胃溃疡指数、胃溃疡抑制率并对胃溃疡病灶部位进行组织学观察。结果与模型组相比，各受试物均能够降低大鼠胃腺的出血损伤，降低胃溃疡指数，具有良好的抗酒精性胃溃疡作用（王志聪,孙京沙,倪鑫,等. 鳕鱼皮胶原蛋白肽的抗酒精性胃溃疡作用[J]. 中国海洋药物杂志, 2012, 35(5):17-22 ）。

目前，胶原蛋白肽的保健功能主要在美容护肤、补钙健骨、止血免疫等方面，但是现在还未有研究关于胶原蛋白肽对肝脏的损伤保护作用，而现有的肝脏损伤的保护主要依靠各类药物，但是药物都存在一定的毒性和抗药性，生物活性肽是具有无毒、安全的特点，是理想的辅助治疗材料，亟需开发一种对肝脏的损伤保护效果好的生物活性肽。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，以水产加工副产物鳕鱼皮为原料，从中提取具有肝细胞修复作用的胶原蛋白肽，简单易行，生产成本低，可以显著提高水产加工副产品的价值，避免浪费的同时还保护了环境，还能为开发相关功能性食品提供前期基础。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）鳕鱼皮预处理：将鳕鱼皮洗净后用4℃纯水浸泡20-30min，后用浓度0.1-0.2mol/L NaOH 浸泡 6-8小时，用清水冲洗至 pH=7，沥干水分后，用浓度0.1-0.2mol/L的冰醋酸溶胀10-12小时，最后用剪刀剪碎；

（2）酶解反应：将步骤（1）预处理后的鳕鱼皮与水按照1:4（w/v）的料液比混合，然后加入胰蛋白酶酶解反应；

采用胰蛋白酶酶解的产物对肝细胞的损伤修复效果最好。

（3）超滤：步骤（2）酶解反应结束后，灭酶，离心，收集上清液，上清液用超滤膜超滤，截留获得分子量为5-10KDa的组分，冷冻干燥后得GM2组分；GM2组分对肝细胞的损伤修复效果最好。

（4）DEAE-Sepharose FF离子交换层析分离：将GM2组分上DEAE-Sepharose FF离子交换柱，采用pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液作为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后得到GM2-2组分；GM2-2组分对肝细胞的损伤修复效果最好。

（5）Sephadex G-25层析分离：将GM2-2组分经Sephadex G-25凝胶柱洗脱后，从上样开始计时，收集90-100min时间段洗脱液获得GM2-2-3组分，冷冻干燥后得到肝病辅食型胶原蛋白肽。GM2-2-3组分对肝细胞的损伤修复效果最好。

作为优选，步骤（2）酶解条件为：胰蛋白酶用量为每g鳕鱼皮加入2000U，酶解温度50℃，pH 6，时间8h。这样的条件下酶解效果最好，所得产物对肝细胞的损伤修复效果最好。