[发明专利]土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明属于土壤环境污染物的检测技术领域，具体涉及一种土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法。

背景技术

1928年Alexander Fleming发现了青霉素，20世纪40年代青霉素大规模投入生产，随后又相继发现了链霉素、四环素、万古霉素、甲氧西林等抗生素。我国是抗生素的生产和消费大国，其中2007年生产抗生素21万吨，除出口约3万吨外，在国内使用18万吨(其中养殖业占9.7万吨)。目前抗生素已经广泛的用于人类和动物的疾病预防及治疗，同时也被用作生长促进剂来提高畜禽的生长速率。现代养殖场中大量使用抗生素已经成为一种习惯，在使用一种抗生素产生耐药性的情况下，养殖场一方面加大抗生素使用剂量，另一方面在不断寻找新的抗生素，同时还会使用复方抗生素制剂，农业土壤是兽用抗生素的主要归宿地，大部分抗生素以母体化合物形式随粪尿排出体外，80％以上的畜禽粪未经综合处理，便直接施于农田，导致土壤中抗生素抗性基因(ARGs)和耐受菌的积累。土壤中的微生物种类繁多，数量巨大，高密度的微生物更容易促进基因的横向转移，ARGs可以整合到一些可移动基因元件上，如质粒、转座子、整合子等，通过直接或者间接接触(如食物链)等途径进入人体，增加人体的耐药性，进而对人体健康以及整个生态系统构成长期潜在危害。抗生素疗法是感染疾病的主要甚至是唯一疗法，而致病菌耐药性的增加和扩散已经成为全球疾病治疗所面临的一个巨大问题。

Pruden等人早在2006年就提出，将ARGs作为一种新型的环境污染物。抗生素抗性基因种类繁多，数量巨大，比如编码四环素类抗性基因就有三大类超过四十种，建立土壤中ARGs的定量检测方法，对于进一步系统地监测土壤环境中抗生素抗性基因及其评价其生态风险是十分必要的。目前没有商品化的抗性基因标准品，而且普通PCR只能定性的检测基因的有无，而且灵敏度不高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法，包括以下步骤：

1)、选用经常服用抗生素的猪，服用的抗生素种类应包括目的抗性基因所对应的抗生素；

提取上述猪的猪粪的基因组DNA，并以猪粪DNA为模板，采用PCR扩增目的抗性基因片段；

备注说明：如果无法获得目的抗性基因，则重选猪粪，重复上述步骤1)，直至能获得该目的抗性基因为止；

2)、切胶回收纯化扩增后的目的抗性基因，将抗性基因连接在T载体上，然后转化感受态大肠杆菌细胞，涂LB平板后挑选阳性克隆子，用LB培养液培养(扩大培养)；

3)、用琼脂糖凝胶电泳检测扩大培养菌液的质量，选克隆成功的菌液提取质粒，检测质粒浓度，换算出质粒所携带抗性基因的拷贝数，并按10倍为稀释梯度稀释备用，作为抗性基因标准品；

4)、提取土壤的基因组DNA，将土壤样品DNA和抗性基因标准品同时进行定量PCR扩增，根据抗性基因标准品的拷贝数和其扩增的CT值生成标准曲线，进而得出土壤样品的抗性基因的拷贝数。

作为本发明的土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法的改进：

所述目的抗性基因，其长度为100-350bp；

所述目的抗性基因为：青霉素类抗性基因blaTEM基因、四环素类抗性基因tetC基因、四环素类抗性基因tetM基因。

作为本发明的土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法的进一步改进：

所述步骤3)中，质粒浓度换算成每μL质粒溶液所携带的绝对模板拷贝数的公式为：Copies/μL＝[x/(a+b)×660]×10^-9×6.02×10²³，其中x为质粒浓度(ng/μL)；a为载体长度(bp)；b为目的抗性基因长度(bp)。

作为本发明的土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法的进一步改进：所述步骤1)中，

PCR扩增的反应体系为：

2×EasyTaq PCR SuperMix              10μL；

DNA模板(浓度为18～20ng/μL，例如为19.1ng/μL)              1μL；

目的抗性基因的前后引物(10μM)              各1μL；

余量为二次重蒸水；

反应条件为：

94℃预变性4min，

72℃延伸7min。