[发明专利]土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法

权利要求书

1.土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、选用经常服用抗生素的猪；

提取上述猪的猪粪的基因组DNA，并以猪粪DNA为模板，采用PCR扩增目的抗性基因片段；

2)、切胶回收纯化扩增后的目的抗性基因，将抗性基因连接在T载体上，然后转化感受态大肠杆菌细胞，涂LB平板后挑选阳性克隆子，用LB培养液培养；

3)、用琼脂糖凝胶电泳检测扩大培养菌液的质量，选克隆成功的菌液提取质粒，检测质粒浓度，换算出质粒所携带抗性基因的拷贝数，并按10倍为稀释梯度稀释备用，作为抗性基因标准品；

4)、提取土壤的基因组DNA，将土壤样品DNA和抗性基因标准品同时进行定量PCR扩增，根据抗性基因标准品的拷贝数和其扩增的CT值生成标准曲线，进而得出土壤样品的抗性基因的拷贝数。

2.根据权利要求1所述的土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于：

所述目的抗性基因，其长度为100-350bp；

所述目的抗性基因为：青霉素类抗性基因blaTEM基因、四环素类抗性基因tetC基因、四环素类抗性基因tetM基因。

3.根据权利要求1或2所述的土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于：所述步骤3)中，质粒浓度换算成每μL质粒溶液所携带的绝对模板拷贝数的公式为：Copies/μL＝[x/(a+b)×660]×10^-9×6.02×10²³，其中x为质粒浓度(ng/μL)；a为载体长度(bp)；b为目的抗性基因长度(bp)。

4.根据权利要求1、2或3所述的土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于：所述步骤1)中，

PCR扩增的反应体系为：

2×EasyTaq PCR SuperMix              10μL；

DNA模板(浓度为18～20ng/μL)              1μL；

目的抗性基因的前后引物(10μM)              各1μL；

余量为二次重蒸水；

反应条件为：

94℃预变性4min，

72℃延伸7min。

5.根据权利要求4所述的土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于：

当目的抗性基因为青霉素类抗性基因blaTEM基因时，前后引物序列分别为AAGCCATACCAAACGACGAG，CCGCCTCCATCCAGTCTAT；退火温度为66℃；

当目的抗性基因为四环素类抗性基因tetC基因时，前后引物序列分别为GCGGGATATCGTCCATTCCG，GCGTAGAGGATCCACAGGACG；退火温度为68℃；

当目的抗性基因为四环素类抗性基因tetM基因时，前后引物序列分别为ACAGAAAGCTTATTATATAAC，TGGCGTGTCTATGATGTTCAC；退火温度为46℃。

6.根据权利要求5所述的土壤中抗生素抗性基因的定量检测方法，其特征在于：所述步骤4)中，生成标准曲线的R²值应大于0.98，越接近于1，结果可信度越高；扩增效率E的范围应在0.8-1.2，越接近于1，越理想。