[发明专利]一种解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7抗菌蛋白产品及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵液分离纯化制备技术领域，特别涉及一种解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白产品及其制备方法。

背景技术

植物病害是一个全球性的问题，造成了巨大的经济损失。联合国粮农组织(FAO)的统计数据表明，植物病害平均每年引起的减产损失约为总产量的10％-15％，其中由真菌引起的植物病害约占80％。目前主要使用化学杀菌剂来控制植物病害，虽然化学杀菌剂能有效地减免植物病害，但化学杀菌剂亦造成负面影响。化学药剂的残留威胁着人畜的健康，危害着环境。因此研究开发可替代化学杀菌剂的新方法来控制植物病害是目前研究的一个重要方面。

随着人们环保意识的不断增强以及高新技术在农业领域中的应用，利用有益生物来控制植物病害越来越得到广泛重视。我国对生物防治的研究始于50年代初期，目前已经有研究者将优良的拮抗微生物菌体应用于植物病害的生物防治，并取得显著成效，但是拮抗微生物所产拮抗物质的研究大都停留在实验室阶段，主要研究的是拮抗菌产抗菌物质的种类、抗菌物质的分离纯化方法及抑菌机理等，只有少数如乳酸链球菌素、纳他霉素等得到了商品化应用。

解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7系本发明申请人自山东省莱芜市生姜大田土壤中分离得到，目前已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2013098(专利申请号：201310112580.9，发明名称：广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用)。该菌株的菌体及发酵液具有拮抗桃根霉腐烂病、黄瓜枯萎病、番茄灰霉病、枣炭疽病、梨青霉病、苹果褐腐病、苹果斑点落叶病、西瓜枯萎病等植物病原菌引起的植物病害及果蔬菜采后病害以及拮抗金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌、酵母等食源性致病菌和腐败菌的作用。该文献没有进一步研究其各种制剂。

发明内容

本发明的目的是对解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7进一步研究，提供一种解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7抗菌蛋白产品及其制备方法。本发明将硫酸铵沉淀、超滤、柱层析等分离纯化技术及喷雾干燥技术有机结合，提供了一种简单、高效、低成本的纯化并制备解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7抗菌蛋白的方法。所制备的抗菌蛋白产品纯度较高，水溶性和抑菌性能良好，具有工业化应用前景。

本发明的技术方案是：一种解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7抗菌蛋白产品的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)硫酸铵沉淀

将解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7发酵液于4℃，12000-13000rpm离心10-20分钟，收集发酵上清液，边搅拌边加入固体硫酸铵至硫酸铵浓度为50-60％饱和度，4℃静置过夜；12000-13000rpm离心10-20分钟，收集沉淀，加入20-50mM pH6.5-8.0的磷酸盐缓冲液复溶，并于12000-13000rpm离心10-20分钟，收集上清液，即为抗菌蛋白粗提液；

(2)超滤脱盐浓缩

将步骤(1)的抗菌蛋白粗提液置于超滤装置中，于4℃，采用5000Da的超滤膜过滤，截留部分添加20-50mM pH6.5-8.0的磷酸盐缓冲液，重复超滤2-4次，收集截留部分，即为脱盐浓缩后的抗菌蛋白粗提液，相对于发酵上清液浓缩了10-60倍；

(3)抗菌蛋白的进一步纯化

采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析，将步骤(2)脱盐浓缩后的抗菌蛋白粗提液上样，然后先采用50mM pH6.5-7.0的磷酸盐缓冲液洗脱1个柱体积，再采用0.25M的NaCl溶液(采用50mM pH6.5-7.0的磷酸盐缓冲液配制)洗脱1-2个柱体积，洗脱除去杂蛋白；最后采用0.25-0.6M的NaCl溶液(采用50mM pH6.5-7.0的磷酸盐缓冲液配制)梯度洗脱4-5个柱体积，收集到2个洗脱峰，即为抗菌蛋白样品；

(4)再次超滤脱盐浓缩

将步骤(3)的抗菌蛋白样品置于超滤装置中，于4℃，采用5000Da的超滤膜过滤，截留部分添加适量20-50mM pH6.5-8.0的磷酸盐缓冲液，重复2-4次，收集截留部分，即为脱盐浓缩后的抗菌蛋白样品；

(5)喷雾干燥

将步骤(4)脱盐浓缩后的抗菌蛋白样品在进口温度130℃，物料流速3.3mL/min条件下进行喷雾干燥，收集喷干粉，即为抗菌蛋白产品。