[发明专利]鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种PCR试剂盒及检测方法，特别是涉及一种鉴别我国南疆3种常见蛉种(长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉)的多重PCR试剂盒及检测方法。

背景技术

白蛉属于双翅目毛蛉科白蛉亚科(Phlebotominae)，是一类体小多毛的吸血昆虫，全世界已知800多种，其中约10％蛉种已被证实可传播利什曼病等多种疾病。特定的蛉种只能传播特定种类的利什曼原虫，不同蛉种有不同的生物学特征，对应有不同的控制策略。传统形态学种类鉴定存在很大局限性，受发育状态的限制，白蛉主要是根据成虫的内部解剖结构、外部形态，或者雄虫外生殖器的形态特征进行物种鉴定，卵、幼虫、蛹等非成虫虫态一般不能鉴定。肢体残缺的种类就很容易造成种类鉴定不准确或者根本无法鉴定。而且培养一个传统的分类工作者往往需要数年的专业培训，不断缩减的分类学家队伍，使分类学发展面临巨大的挑战。

然而，分子生物学鉴定方法更为方便简单，在物种鉴定方面显示了独特的优势。目前已被广泛应用于昆虫物种的鉴定，但目前我国传统蛉种鉴别方法存在不足，迫切需要新型分子生物学蛉种鉴别方法的出现。

目前南疆是我国内脏利什曼病病例最多的地区，占全国病例一半以上。分布于南疆的蛉种有长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉以及微小司蛉新疆亚种。长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉均为我国内脏利什曼病传播媒介，微小司蛉新疆亚种为野生野栖蛉种，非内脏利什曼病传播媒介，近年南疆黑热病媒介调查显示该蛉种占当地蛉种组成较小，不足0.1％，故不做常见蛉种研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种鉴别我国南疆3种常见蛉种(长管白蛉、吴氏白蛉、亚历山大白蛉)的多重PCR试剂盒及检测方法。本发明基于我国南疆3种常见蛉种COI基因序列的差异，设计了多重PCR试剂盒及检测方法，而且该方法可靠、简便、易行，可用于我国南疆3种常见蛉种的鉴定。

为解决上述技术问题，本发明的鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR试剂盒，包括：

(1)鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR通用的正向引物，其序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR通用的反向引物，其为SEQ ID NO.2所示的序列、SEQ ID NO.3所示的序列和SEQ ID NO.4所示的序列；

其中，我国南疆3种常见蛉种包括：长管白蛉(Ph.longiductus)、吴氏白蛉(Ph.wui)和亚历山大白蛉(Ph.Alexandri)。

进一步的，所述试剂盒还包括：聚合酶链式反应试剂。其中，所述聚合酶链式反应试剂，可包括：

1)聚合酶链式反应缓沖液(即10×PCR缓冲液)；

2)四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)，四种脱氧核糖核苷酸的浓度均为2.5mmol/L；

3)牛血清白蛋白(BSA)，其为40mg/mL；

4)ExTaq酶，其浓度为5U/μL；

5)灭菌双蒸水。

进一步的，所述聚合酶链式反应缓沖液的成份如下：

Tris-HCl100mmol/L

KCl 500mmol/L

MgCl₂ 15mmol/L。

进一步的，所述试剂盒中的正向引物、SEQ ID NO.2所示的序列、SEQ ID NO.3所示的序列和SEQ ID NO.4所示的序列的浓度均为10μmol/L。

另外，本发明还公开了一种利用上述试剂盒进行鉴别我国南疆3种常见蛉种的多重PCR方法，其步骤包括：

(1)按照常规方法(如采用DNA提取试剂盒)，提取我国南疆3种常见蛉种的DNA，作为DNA模板；

(2)利用上述的试剂盒，将提取的DNA(DNA模板)在PCR扩增仪上进行扩增；

(3)对扩增的产物进行电泳鉴别。

所述步骤(2)中，扩增中的反应体系如下：

聚合酶链式反应缓沖液5μL、2.5mmol/L dNTPs4μL、10μmol/L的如SEQ ID NO.1所示的正向引物3.0μL、10μmol/L的如SEQ ID NO.2所示的序列1μL、10μmol/L的如SEQ ID NO.3所示的序列1μL、10μmol/L的如SEQ ID NO.4所示的序列1μL、40mg/mL牛血清白蛋白1μL、5U/μL ExTaq聚合酶0.36μL、DNA模板1.5μL，用灭菌双蒸水补足体积至50μL；

扩增中的反应条件如下：