[发明专利]一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的CTL制备方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞的培养领域，具体地，涉及一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的CTL制备方法。

背景技术

目前，肿瘤已成为威胁人类生命和健康的首要敌人，其发病率也在逐年上升，《世界癌症报告》显示全球癌症病例由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人；每年死于癌症的人数不断增加，由820万人增加至1300万人，到2030年新增癌症病例将增加50%，达到每年2160万人。癌症是中国居民死亡的主要原因之一，根据我国肿瘤发病情况登记年报显示，每年新发肿瘤病例约为350万例，全国每分钟有6人被诊断为癌症，约有250万人死于癌症。预计，到2020年，新发病例将达到390万，因恶性肿瘤而死亡的人数将达294万。手术、放疗和化疗是治疗肿瘤的三大常规方式，能在短时间内有效减轻肿瘤负荷，但因其不能有效清除肿瘤细胞，手术后微小残存病灶、对化疗产生耐药及对放疗不敏感的患者肿瘤易发生转移，且副作用大等弊端，使得肿瘤的临床疗效低。肿瘤细胞免疫治疗作为一种全新的肿瘤全身治疗方式，能系统杀灭肿瘤细胞，有效抑制肿瘤细胞的转移、扩散和复发，副反应小等良好的临床治疗效果，克服了肿瘤传统治疗方式的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端，是目前国际上公认的继手术、放疗和化疗之后最有希望完全消灭肿瘤细胞的第四大治疗肿瘤的新技术。

目前，肿瘤细胞免疫治疗应用于临床的细胞有DC细胞（树突状细胞）、CIK细胞（细胞因子诱导的杀伤细胞）、DC-CIK细胞和CTL细胞，其中CTL（细胞毒性T淋巴细胞）因具有肿瘤特异性，能直接靶向作用于肿瘤细胞，对肿瘤细胞杀伤活性高等特点，而成为目前临床研究的热点。肿瘤细胞免疫治疗在临床上取得了不错的疗效，特别是，2010年美国FDA批准了Dendreon公司的前列腺癌疫苗Provenge（商品名：sipuleucel-T）的上市申请，成为第一支通过FDA批准的DC疫苗，也是近20年以来肿瘤生物治疗领域的重大突破，推动了肿瘤细胞免疫治疗在临床治疗恶性肿瘤中的应用。然而，经体外扩增回输到病人体内的有效的效应细胞数量较少，能有效作用于肿瘤靶细胞的效率较低，因而限制了肿瘤治疗的效果，不能显著的提高肿瘤患者尤其是晚期患者的生存期。另一方面，肿瘤患者的免疫应答能力很弱，CD4⁺CD25⁺调节性T淋巴细胞（Treg）也抑制对肿瘤的免疫应答反应，因此肿瘤患者的免疫系统不能对肿瘤起到有效的杀伤作用，即产生机体对肿瘤耐受。同时，肿瘤微环境通过多种途径促使Treg细胞的数量增加，即释放趋化因子CCL22，将胸腺、骨髓、淋巴结以及外周血中自然产生的Treg趋化至肿瘤局部；产生的VEGF（血管内皮生长因子）、TGF-β1（转化生长因子-β1）、IL-10（白细胞介素-10）能诱导Treg的产生及对胸腺来源的天然Treg具有扩增作用；并且抑制性分子TGF-β、COX-2（环氧化酶-2）、CD70、Galectin-1（半乳糖凝集素-1）、IDO（吲哚胺2,3-双加氧酶）能使CD4⁺CD25⁺Treg转化为CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺Treg，导致肿瘤患者的自身免疫系统不能辨认和清除体内的肿瘤细胞，加剧肿瘤的免疫耐受，使肿瘤无限制生长。由于肿瘤的免疫耐受，使得回输的效应细胞不能在体内引起有效的抗肿瘤免疫应答反应，影响了效应细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。

天然Treg是一个具有免疫调节作用的T淋巴细胞亚群，约占CD4⁺T细胞的5%-10%，起着维持机体自身免疫耐受的作用。越来越多的数据表明，各种肿瘤患者体内的 Treg数量比正常人明显增多，因此肿瘤患者机体处于一个高度免疫耐受的状态。所以，体外采集肿瘤病人外周血单核细胞（PBMC）时，Treg细胞比例高，同时在诱导扩增效应细胞所用的IL-2也能诱导Treg细胞增殖，且能分泌大量IL-10，由此抑制效应细胞的增殖、降低其细胞杀伤活性。

因此，如何提高效应细胞的增殖效率及靶向杀伤肿瘤细胞的活性，打破肿瘤免疫耐受，抑制培养过程中Treg细胞的转化数量，提高细胞免疫治疗的疗效是目前肿瘤细胞免疫治疗技术亟需解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种体外CTL细胞的制备方法，该方法能够显著提高体外CTL细胞增殖的效率及其靶向杀伤肿瘤细胞的活性，抑制肿瘤患者外周血单个核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞转化。