[发明专利]一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的CTL制备方法

权利要求书

1.一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的CTL制备方法，包括以下步骤：

（a）去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞：采集并分离外周血单个核细胞，通过免疫磁珠阴性分选法去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞，得到CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD14⁺的混合细胞；

（b）分离T淋巴细胞和DC细胞：将得到的混合细胞置于无血清培养基中，在37℃、5%CO₂的培养箱中静置孵育，获得T淋巴细胞和DC细胞，

（c）成熟DC细胞的制备：将T淋巴细胞转移至新的培养瓶中；贴壁的DC细胞中加入含有GM-CSF及IL-4的无血清培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中扩增培养5天；第6天，加入肿瘤细胞全抗原，第7天得到负载肿瘤细胞全抗原的DC细胞，并在培养基中加入TNF-α和IL-27，得到成熟的DC细胞；

（d）CIK的制备：将T淋巴细胞转移至经抗CD3单克隆抗体和重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并在无血清培养基中加入IFN-γ，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；第2天在培养基中加入IL-2、IL-12、IL-27，培养至第8天，得到CIK细胞；

（e）CTL细胞的制备：将上述（d）步骤得到的CIK细胞与（c）步骤得到的成熟DC细胞，在含有IL-12、IL-7、抗CD28单克隆抗体的无血清培养基中混合培养；混合培养的第3天，在培养基中加入抗CTLA-4单克隆抗体，继续培养4天即可得到CTL细胞。

2.根据权利要求1所述的CTL制备方法，其特征在于，所述（b）分离T淋巴细胞和DC细胞步骤中，所述无血清培养基为20-40ml的无血清AIM-Ⅴ培养基。

3.根据权利要求1所述的CTL制备方法，其特征在于，所述（c）成熟DC细胞的制备步骤中，GM-CSF为50ng/ml、IL-4为25ng/ml、肿瘤细胞全抗原为50μg/ml、TNF-α为30ng/ml、 IL-27为10-30ng/ml。

4.根据权利要求1所述的CTL制备方法，其特征在于，所述（d）CIK的制备步骤中，抗CD3单克隆抗体为50ng/ml、重组人纤维连接蛋白为1μg/ml、所述无血清培养基为20-40ml无血清AIM-Ⅴ培养基、IFN-γ为1000U/ml、IL-2为20ng/ml、IL-12为5-15ng/ml、IL-27为5-20ng/ml。

5.根据权利要求1所述的CTL制备方法，其特征在于，所述（e）CTL细胞的制备步骤中，CIK细胞和成熟DC细胞的混合比例为10：1、IL-12为5ng/ml、IL-7为5-15ng/ml、抗CD28单克隆抗体为50ng/ml、所述无血清培养基为20ml无血清AIM-Ⅴ培养基、CTLA-4单克隆抗体为50ng/ml-1μg/ml。