[发明专利]一种基于纳米二氧化铈仿生氧化酶的微囊藻毒素比色检测方法

说明书

技术领域

本发明属于环境监测技术领域，涉及一种基于纳米二氧化铈仿生氧化酶的微囊藻毒素比色传感检测方法。

背景技术

微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是一类由产毒水华蓝藻分泌的次级代谢物质，具有强烈的肝毒性。其中，毒性最大的Microcystin-LR(MC-LR)对小白鼠的LD₅₀值仅为43μg/kg，低于剧毒物质氰化钾。如今，水体富营养化程度加剧，水华频发，饮用水源水和自来水厂出水中均有微囊藻毒素检出，其对水体环境和人群健康造成严重威胁，已成为全球关注的重大环境问题之一。由于其急性毒性强，世界卫生组织(WHO)规定饮用水中微囊藻毒素的标准仅为1μg/L。因此，发展灵敏、快速、高效、实时的检测方法对监测环境中的微囊藻毒素具有重要意义。

传统的微囊藻毒素检测方法有仪器检测法，生物法/生化法等，由于其固有的缺陷已难以应对目前的环境监测需求。例如，高效液相色谱法耗时、费力、成本高；全细胞法灵敏度低、特异性差；酶联免疫吸附测定虽然具有较高的灵敏度和选择性，但操作过程复杂，体系对极端环境的适应性差，阻碍了该法的推广使用。近年来，无机纳米材料仿生酶，包括仿生过氧化酶、仿生氧化酶等，可在分子层面上模仿天然酶，不仅拥有接近或高于天然酶的催化性能，且相较于天然酶更稳定，实用性更强，更加经济易于生产，已被广泛运用于传感分析检测中(Chemical Communications,2011,47(23),6695-6697；ACS NANO,2012,6(4),3142-3151)。目前，人们也已利用仿生酶材料成功建立了一些针对藻毒素检测的传感平台(Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2013,103,38-44；Science,2010,330(6001),188-189)，但这些方法均基于仿生过氧化酶的催化性能，即必须在反应体系中加入一定量的H₂O₂，才能实现催化过程的顺利进行。由于H₂O₂不仅易降解，在长期存储过程中易失效，而且其强氧化性易造成生物底物组织结构破坏，影响了实验效率与检测结果。

纳米二氧化铈，基于Ce³⁺与Ce⁴⁺的相互转化作用而具有仿生氧化酶的催化性质，从而可以快速催化氧化多种有机底物，而无需额外添加任何氧化剂。如今纳米二氧化铈仿生氧化酶材料由于其优异的性质已被用于传感分析中(AngewandteChemie-international Edition,2009,48(13),2308-2312；Biosensors and Bioelectronics,2014,52,397-402)。本发明将纳米二氧化铈仿生氧化酶材料应用于水中微囊藻毒素的检测，建立一种微囊藻毒素的比色分析方法，解决了传统方法繁琐耗时、成本高、实用性差等缺点，应用前景非常广泛。

发明内容

本发明解决了现有检测微囊藻毒素方法繁琐耗时、前处理过程复杂、成本高、实用性差等不足，提供了一种简便、快捷、经济、实用的检测水中微囊藻毒素的方法。

六水合硝酸铈和聚丙烯酸在氨水存在条件下，经搅拌，一步合成聚丙烯酸包被的纳米二氧化铈(PNC)，其仿生氧化酶的催化性能可使底物中的显色剂从常态氧化至氧化态，从而使体系吸光度值发生改变。PNC表面羧基经过活化，与微囊藻毒素抗体通过脱水缩合反应结合，形成抗体-纳米二氧化铈复合物。检测时利用纳滤膜分离去除游离的纳米二氧化铈后，与目标物分子，即微囊藻毒素发生抗原-抗体特异性结合，形成抗原-抗体-纳米二氧化铈复合物。再利用纳滤膜过滤分离去除未进行特异性结合的游离的抗体-纳米二氧化铈复合物。过滤截留的抗原-抗体-纳米二氧化铈复合物的浓度与目标物微囊藻毒素的浓度正相关，在显色剂存在条件下，复合物与显色剂发生反应产生颜色变化，并且体系吸光度值在一定范围内与微囊藻毒素的浓度正相关，从而为微囊藻毒素的定量分析提供依据。

本发明提供了一种基于PNC仿生氧化酶的微囊藻毒素的检测方法，具体步骤如下：

(1)向0.05～10mM PNC中依次加入浓度为1～50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和浓度为1～50mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应5～90min，活化PNC表面原有的羧基官能团。