[发明专利]一种双鞭甲藻发酵生产DHA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵生产方法，具体涉及利用双鞭甲藻菌株发酵生产含二十二碳六稀酸的混合油脂。

背景技术

二十二碳六烯酸(cis-4,7,10，13,16，19-docosahexaenoic acid，DHA)是一种极其重要的ω-3系列的长链多不饱和脂肪酸，具有促进婴幼儿大脑发育、保护视力、预防和治疗心血管疾病和提高机体免疫能力等重要生理功能。

目前DHA的商业来源主要是鱼油和微藻。国内鱼油的年产量约4万吨，经精炼提纯DHA含量达30％的鱼油，其价格在4-5万元/吨，进口鱼油为8万元/吨，而DHA微藻油价格为15-20万美元/吨。近几年由于国内鱼油质量不能满足保健品原料的需求以及鱼油资源大量衰减，国内鱼油的进口量明显上升，进而导致市售价格也相继走高，因此寻找微生物来源的DHA就显得日益迫切。而微藻DHA的市场份额在逐年快速上升，有取代鱼油DHA的趋势。但是由于DHA生产技术相对落后，规模小，因此提高DHA生产技术及品质，进军DHA微藻市场前景广阔。

公开号为CN1986822A的专利公开了一种用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸的方法，其所公开的产量为海藻细胞中二十二碳六烯酸含量在30％-50％，获得的海藻细胞为20-40g/L，油脂含量为20-50％，DHA生产率为3.5g/(L·d)。公开号为CN101538592A的专利公开了一种用寇氏隐甲藻工业化发酵生产二十二碳六烯酸的方法，其所公开的最高产量为微藻细胞生物量51g/L，油脂含量为72％，DHA含量为55.3％，EPA含量为0.2％，DHA生产率为4.6g/(L·d)，这也是目前报道的采用寇氏隐甲藻生产DHA的最高生产水平。虽然其DHA生产率较之前的研究有了较大提高，但对于利用微藻进行工业化生产二十二碳六烯酸，大大降低其生产成本，提高单位产量，使微生物发酵产DHA的方法能够得到大力推广和普及使用还是远远不够的。

公开号为CN102391955A的专利公开了一种双鞭甲藻的诱变筛选方法，其采用紫外+LiCl、硫酸二乙酯类对双鞭甲藻进行复合诱变，从而获得性能较优良的菌株，但这种诱变的长期遗传稳定性不高，菌株产DHA的产量不稳定，不适合工业化生产，同时，通过诱变的菌株的基因组可预测性不高，其产品产量均发生变化，这对后期的纯化提出了更高的技术要求，不适用于规模化的生产。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种用双鞭甲藻(Crypthecodinium cohnii)为菌种，工业化发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，该方法能够低成本、大量生产绿色环保的高品质DHA油脂。

本发明提供的技术方案是：

用双鞭甲藻发酵生产DHA的方法，包括以双鞭甲藻为菌种，采用包括碳源、氮源和无机盐的培养基，通过溶氧调控策略发酵制得二十二碳六烯酸油脂(DHA)，具体如下：

1)将双鞭甲藻菌株接入装有350mL培养基的2L摇瓶，在22-32℃的摇床中以180rpm的转速，培养20-30h；

2)按照0.4-1％的接种量将摇瓶的菌种接入装有1m³培养基的2m³一级种子发酵罐中，培养温度22-32℃，通气量1-2vvm，压力0.02-0.05MPa，培养25-35h；

3)按照1-3％的接种量将一级种子罐的菌种接入装有8m³培养基的15m³二级种子发酵罐中，培养温度22-32℃，通气量1-2vvm，压力0.02-0.05MPa，培养15-25h；

4)按照1-3％的接种量将二级种子罐的菌种接入装有40m³培养基的100m³发酵罐中，培养温度22-32℃，压力0.02-0.05MPa，通气量1-2vvm，通过溶氧调控策略将DO控制在50％，整个发酵过程流加40％的氨水控制pH在6.0-7.0，过程中葡萄糖浓度维持在1-5g/L，流加碳源发酵培养60-80h，终止发酵，放罐，测定发酵液中细胞干重达70-110g/L，油脂含量达40-60％，DHA占总油脂含量为45-55％，DHA生产率最高可达8.7g/(L·d)。

所述的菌种为双鞭甲藻为(Crypthecodinium cohnii，ATCC30556)斜面保藏菌株。

发酵培养基碳源中添加20％处理后的甘油。

发酵过程中溶氧转速耦联控制DO在50％。