[发明专利]一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，属于生物技术领域。

背景技术

牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrhea，BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovineviral diarrheavirus，BVDV)引起的传染病，呈地方性流行。本病可通过接触及气溶胶等方式传播，病牛及隐性感染牛的呼吸道、眼分泌物、乳汁及粪便等排泄物均含有病毒，在封闭式牛群中可呈暴发式流行，给畜牧业生产和相关商业领域造成巨大的经济损失。

BVDV是单股正链RNA病毒，有囊膜，基因组由5’端非翻译区(5’NTR)，一个长的开放阅读框，编码病毒的结构蛋白，包括病毒的衣壳蛋白和囊膜蛋白(Erns、E1和E2)和非结构蛋白，和3’端非翻译区(3’NTR)组成。根据BVDV基因组5’端非翻译区(5’NTR)序列不同，把BVDV分为牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV-1)和牛病毒性腹泻病毒II型(BVDV-2)。BVDV流行株的基因分型在流行病学研究、疫苗研制乃至疫病的控制和消灭等方面都具有重要的意义。

实时荧光定量RT-PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增、荧光技术高特异性和光谱技术的敏感性及实时定量分析的优点，仪器自动分析，效率高、无后续处理，克服了常规PCR定性检测的一些不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性，缩短了实验时间、简化了实验操作。

气溶胶是由悬浮于气体介质中的固态或液态微小粒子形成的相对稳定的分散体系，其粒径一般为0.001-100μm。空气生物气溶胶研究主要集中在动物舍环境气载细菌、真菌及其毒素、内毒素等的检测，而病毒气溶胶浓度低、难以收集，样品处理以及病毒的鉴定等方面比其他微生物的研究方法及步骤更加复杂，影响因素多，对病毒气溶胶的研究不够深人。迄今为止，还没有应用SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术检测鉴别牛病毒性腹泻病毒气溶胶样品的研究报道。本研究应用荧光RT-PCR对收集到的奶牛场不同环境中空气样品中牛病毒性腹泻病毒进行检测，操作简便、快速，特异性强，灵敏度高，结果可靠。

发明内容

针对上述现有技术，一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，可同时对气溶胶样本中牛病毒性腹泻病毒不同基因型进行鉴别诊断。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，步骤如下：

(1)采集气溶胶样本；

进一步地，采集气溶胶样本的方法为：采用国际标准的全玻璃液体冲击式采样器(all-glass-impinger，简称AGI)，以10mLpH值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集养殖场环境中的气溶胶样本；

(2)提取气溶胶样本中病毒的RNA和cDNA；

进一步地，提取RNA和cDNA的方法为：将采集到的10mL气溶胶样本在4℃下12000r/min离心30min，取上清液1mL，应用病毒RNA试剂盒(商业化产品，现有技术中的常规试剂盒)提取病毒的总RNA；将RNA提取物溶解于50μLRNAase-free水中，按照FermentasRevertAid^TMFirstStrandcDNASynthesisKit说明书进行RT-PCR反应，得到cDNA；

(3)检测：以上述提取的cDNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：

所述试剂盒由特异性引物、牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY-T3-B1、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂(现有技术中已有的常规试剂)和ddH₂O组成；所述的SYBRGreenⅠ实时荧光定量RT-PCR试剂盒为PremixExTaq^TMII(TliRNaseHPlus)试剂盒(购自大连宝生物)。采用SYBRGreenⅠ荧光染料的方法，要比Taqman探针方法简便，价格相对较低。

所述牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY-T3-B1由序列为SEQIDNO.9所示的DNA片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术。

所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对；

所述通用型检测引物对的序列如下：