[发明专利]一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法

权利要求书

1.一种检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)采集气溶胶样本；

(2)提取气溶胶样本中病毒的RNA和cDNA；

(3)检测：以上述提取的cDNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：

所述试剂盒由特异性引物、牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY-T3-B1、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH₂O组成；

所述牛病毒性腹泻病毒阳性质粒pEASY-T3-B1由序列为SEQIDNO.9所示的DNA片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒；

所述特异性引物选自①通用检测引物对或/和②牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对；

所述通用型检测引物对的序列如下：

上游引物RT-F为5′-TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTAA-3′；

下游引物RT-R为5'-CCCTATCAGGCTGTATTCGT-3'；

所述牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对的序列如下：

牛病毒性腹泻病毒I型鉴别检测引物对：

上游引物RT-1-F为5′-TGAGTACAGGGTAGTCGTCAGT-3′；

下游引物RT-1-R为为5′-GCCTCTGCAGCACCCTATCA-3′；

牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对：

上游引物RT-2-F为5′-AGTCTCGAGATGCCATGTGGACGA-3′；

下游引物RT-2-R为5′-GTCTCTGCTACACCCTATCAG-3′；

(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；

(5)判断：当所用特异性引物为通用检测引物对时，若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒；

当所用特异性引物为牛病毒性腹泻病毒I型、牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对时，若对应于牛病毒性腹泻病毒I型鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒I型；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒I型；

若对应于牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型鉴别检测引物对的溶解曲线为S型，则表明气溶胶样本中含有牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛病毒性腹泻病毒Ⅱ型。

2.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，采集气溶胶样本的方法为：采用全玻璃液体冲击式采样器，以10mLpH值7.0的磷酸盐缓冲液为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集气溶胶样本。

3.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，提取RNA和cDNA的方法为：将采集到的10mL气溶胶样本在4℃下12000r/min离心30min，取上清液1mL，应用病毒RNA试剂盒提取病毒的总RNA；将RNA提取物溶解于50μLRNAase-free水中，按照FermentasRevertAid^TMFirstStrandcDNASynthesisKit说明书进行RT-PCR反应，得到cDNA。

4.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，PCR的扩增反应体系为20μL：2×SYBRPremixExTaqII10μL，模板2μL，上游引物和下游引物各0.5μL，RNaseFreeddH₂O7μL。所述的定量引物对中，上游引物和下游引物在反应体系中的终浓度均为0.25μmol/L。

5.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，PCR的反应条件为：预变性95℃30s，然后按照95℃变性5s、65℃退火延伸30s，进行40个循环；溶解曲线为95℃5s、65℃60s、95℃Continuous；最后50℃30s结束反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。