[发明专利]一种检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法，属于生物技术领域。

背景技术

牛传染性鼻气管炎病毒(InfectiousBovineRhinotracheitisVirus,IBRV)是一种泛嗜性病毒，侵入牛体后可侵染并潜伏于多个部位，可引起牛多系统感染，使病牛长期带毒并可在一定时期内排毒，造成牛群的大范围感染。该病的主要传染源为病牛以及无症状的带毒牛，其传播途径为呼吸道、生殖道，病毒随鼻、眼以及阴道分泌物、精液等排出体外。该病可通过被污染的空气飞沫感染牛群，在过分拥挤、封闭式环境中更易快速传播，对牛群肥育率、产奶量和繁殖影响极大。因此，世界动物卫生组织(OIE)将该病列为B类疾病，也是我国进境动物必检疾病之一。

IBRV是双链DNA病毒，有囊膜，基因组长约138kb，由一个长独特区(UL，106kb)和一个短独特区(Us，10kb)及Us区两侧的重复序列(IRs和TRs，各11kb，序列相同但方向相反)组成。IBRV基因组至少编码70个左右基因，其中有11种为糖蛋白。由于IBRV易形成潜伏感染，在临床上不表现症状或表现轻微临床症状，建立针对IBRV基因的PCR检测方法，为流行病学调查、临床诊断、疫苗研制乃至疫病的控制及消除等方面都具有重要的意义。

PCR在病毒检测上具有特异、灵敏、高效等特点，用PCR方法检测病毒核酸，不受中和抗体的影响。而实时荧光定量PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增、荧光技术高特异性和光谱技术的敏感性及实时定量分析的优点，仪器自动分析，效率高、无后续处理，更有利于对低浓度的样本进行检测，极大地提高了检测的敏感性和特异性，缩短了实验时间、简化了实验操作。

气溶胶是由悬浮于气体介质中的固态或液态微小粒子形成的相对稳定的分散体系，其粒径一般为0.001-100μm。而悬浮在气体(如空气)中含有病毒的液态或固态微粒称为病毒气溶胶。随着集约化、规模化畜牧生产的发展，病毒气溶胶在病毒性传染病传播中所占的重要地位逐渐被人们所认识。牛传染性鼻气管炎病毒可通过污染的空气传播，阻碍了畜牧业生产效率的提高和发展。因此全面了解畜禽舍内外环境质量，对流行病的预防和监控十分重要。

目前，关于细菌等空气微生物气溶胶采集及诊断方法的研究报道较多，由于病毒气溶胶难以收集、浓度较低，且传统检测方法灵敏度低，故研究受限。迄今为止，还没有应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术检测气溶胶载IBRV的研究报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法，可以应用于牛场环境中IBRV的检测，为牛传染性鼻气管炎病毒的流行病学调查及气溶胶传播方式的防控提供支撑。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法，步骤如下：

(1)采集气溶胶样本；

进一步地，采集气溶胶样本的方法为：采用国际标准的全玻璃液体冲击式采样器(all-glass-impinger，简称AGI)，以10mLpH值7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集养殖场环境中的气溶胶样本；

(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；

进一步地，提取基因组总DNA的方法为：将采集到的10mL气溶胶样本在4℃下12000r/min离心30min，取上清液1mL，应用病毒DNA试剂盒(商业化产品，现有技术中的常规试剂盒)提取基因组总DNA；

(3)检测：以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：

所述试剂盒由特异性引物、牛传染性鼻气管炎病毒阳性质粒pEASY-T3-D、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂(现有技术中已有的常规试剂)和ddH₂O组成；所述的SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂盒为Premix Ex Taq^TMII(TliRNaseHPlus)试剂盒(购自大连宝生物)。采用SYBRGreenⅠ荧光染料的方法，要比Taqman探针方法简便，价格相对较低。

所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性质粒pEASY-T3-D是由序列为SEQIDNO.5所示的DNA片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术。

所述特异性引物的序列如下：