[发明专利]一种检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法

权利要求书

1.一种检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：步骤如下：

(1)采集气溶胶样本；

(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；

(3)检测：以上述提取的基因组总DNA为模板，采用试剂盒进行SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR，具体如下：

所述试剂盒由特异性引物、牛传染性鼻气管炎病毒阳性质粒pEASY-T3-D、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH₂O组成；

所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性质粒pEASY-T3-D是由序列为SEQIDNO.5所示的DNA片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒；

所述特异性引物的序列如下：

上游引物IBRV-F为5′-ACGGACGACGAGCTGGGACT-3′；

下游引物IBRV-R为5'-CGGCAGCGAAACCATGAAAT-3'；

(4)建立标准曲线和溶解曲线：建立阳性标准质粒的标准曲线，以及扩增体系的溶解曲线；

(5)判断：若溶解曲线为S型曲线，则表明气溶胶样本中含有牛传染性鼻气管炎病毒；若溶解曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有牛传染性鼻气管炎病毒。

2.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，采集气溶胶样本的方法为：采用全玻璃液体冲击式采样器，以10mLpH值7.0的磷酸盐缓冲液为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集20min，收集气溶胶样本。

3.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，提取基因组总DNA的方法为：将采集到的10mL气溶胶样本在4℃下12000r/min离心30min，取上清液1mL，应用病毒DNA试剂盒提取基因组总DNA。

4.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，PCR的扩增反应体系为20μL：2×SYBRPremixExTaqII10μL，模板2μL，上游引物和下游引物各0.5μL，RNaseFreeddH₂O7μL。

5.根据权利要求1所述的检测气溶胶中牛传染性鼻气管炎病毒的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，PCR的反应条件为：预变性95℃30s，然后按照95℃变性5s、63℃退火延伸30s进行40个循环；溶解曲线为95℃5s、65℃60s、95℃Continuous；最后50℃30s结束反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

6.用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的特异性引物，其特征在于：所述特异性引物的序列如下：

上游引物IBRV-F为5′-ACGGACGACGAGCTGGGACT-3′；

下游引物IBRV-R为5'-CGGCAGCGAAACCATGAAAT-3'。

7.权利要求6所述的特异性引物在制备检测牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒中的应用。

8.权利要求6所述的特异性引物在检测牛传染性鼻气管炎病毒中的应用。

9.一种用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由特异性引物、牛传染性鼻气管炎病毒阳性质粒pEASY-T3-D、SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR试剂和ddH₂O组成；

所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性质粒pEASY-T3-D是由序列为SEQIDNO.5所示的DNA片段与pEASY-T3载体相连接后得到的重组质粒；

所述特异性引物的序列如下：

上游引物IBRV-F为5′-ACGGACGACGAGCTGGGACT-3′；

下游引物IBRV-R为5'-CGGCAGCGAAACCATGAAAT-3'。

10.权利要求9所述的试剂盒在检测牛传染性鼻气管炎病毒中的应用。