[发明专利]一种精氨酸脱亚胺酶的重组制备方法

说明书

 

技术领域

本发明属于生物技术及制药领域。更具体而言，本发明涉及一种重组精氨酸脱亚胺酶发明的制备方法，包括在大肠杆菌中的重组表达方法、包涵体变性及复性方法，采用本方法重组制备的精氨酸脱亚胺酶N末端不含有甲硫氨酸且酶比活性达20单位以上。

 

背景技术

精氨酸脱亚胺酶（Arginine Deiminase,以下简称ADI），是一种分子量约为46kd的蛋白酶，有多种微生物来源，包括人型支原体（Mycoplasma hominus）、精氨酸支原体（Mycoplasma arginini）、产气荚膜梭状芽孢杆菌（Clostridium perfringens）、恶臭假单胞菌(Pseudomonas pudita)等，其中以支原体来源的精氨酸脱亚胺酶活性最高。精氨酸脱亚胺酶在体内外均能将L-精氨酸降解为瓜氨酸和氨。

L-精氨酸是哺乳动物的一种重要营养物质，在细胞分裂过程中起着重要作用。人体正常细胞在氮的存在下，能够依靠精氨酰琥珀酸合成酶（以下简称ASS）利用瓜氨酸合成精氨酸，也就是说，人体正常细胞可以不需要外来精氨酸，通过自身合成精氨酸满足需要，即精氨酸是人体正常细胞非必需氨基酸。而某些癌症细胞，是精氨酸营养缺陷型，即这些癌症细胞缺乏精氨酰琥珀酸合成酶（以下简称ASS）的基因而不能自身合成精氨酸，只能利用外源的精氨酸才能存活。因此，通过降低血清精氨酸的水平，可阻断ASS缺陷型癌细胞精氨酸供给，即营养饥饿的方法实现抑制癌细胞增殖的目的。

已知人体多种癌细胞中均存在不同程度的ASS缺陷，如黑色素瘤、肝癌、肺癌、白血病、膀胱癌、间皮瘤、胰腺癌、脑瘤等，其中，恶性黑色素瘤和肝癌是典型的ASS缺陷型癌症细胞，体内外抑癌实验研究表明，重组精氨酸脱亚胺酶（ADI）能有效抑制抑制恶性黑色素瘤和肝癌的增殖并诱导其凋亡；两种肿瘤的荷癌裸鼠给予重组ADI后可显著抑制黑色素瘤和肝癌细胞的体内生长。

恶性黑色素瘤和肝癌是两种严重威胁人类生命的恶性肿瘤，患者在确诊后的一年内存活率较低。恶性黑色素肿瘤在白种人国家发病率较高，且近年的发病率正迅速增加。在世界上肝病流行的地区如中国，肝癌的发病率高。目前用于治疗该两种癌症的方法，主要是手术、化疗和放疗，但效果均不理想。而重组精氨酸脱亚胺酶特别是经聚乙二醇化修饰后，为治疗恶性黑色素瘤和肝癌提供了一种新的手段，并经临床试验证明有明显的治疗效果。

微生物来源的重组精氨酸脱亚胺酶血清半衰期只有5小时，且重复注射给药后会诱发严重的人体免疫反应。聚乙二醇是一种亲水性的大分子高聚物，蛋白或酶聚乙二醇化后能增加稳定性、降低其免疫原性和延长体内半衰期。例如用于治疗急性淋巴细胞白血病的聚乙二醇化L-天冬酰胺酶（商品名Oncaspar）。聚乙二醇化重组精氨酸脱亚胺酶和精氨酸酶已有专利报告（中国专利申请号：98805066.8公开号：CN1255944；中国专利申请号：200610011246.4，公开号：CN 101002945A；中国专利申请号：03825264.3，公开号：CN 1809378A）。美国Polaris公司研发的聚乙二醇化重组精氨酸脱亚胺酶（代号ADI-PEG-SS-20）正在进行                                                期治疗恶性黑色素肿瘤和肝癌的临床试验。

微生物来源特别是人型支原体的精氨酸脱亚胺酶工业制备利用基因工程技术，有文献和专利报道了大肠杆菌的原核表达系统（Jong-Eun Kim et. al., Protein Expression and Purification 53 (2007) 9–15;Satoru Misawa et. al., Journal of Biotechnology 36 (1994) 145-155）。目前，大肠杆菌重组制备精氨酸脱亚胺酶存在以下缺陷，尚未见有文献或专利公开中的解决方法。

1.       据报道，大肠杆菌重组制备的精氨酸脱亚胺酶的N端多出一个甲硫氨酸。

2.       已公开的重组精氨酸脱亚胺酶的包涵体复性均采用盐酸胍作为变性剂。盐酸胍工业化成本较高，且作为变性剂的复性方法，其复性率和和复性后酶比活性有待提高。