[发明专利]一种精氨酸脱亚胺酶的重组制备方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌重组表达N末端不含甲硫氨酸的精氨酸脱亚胺酶的制备方法，包括：重组表达方法、尿素作为变性剂的包涵体复性方法，其中精氨酸脱亚胺酶的氨基酸序列特征为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2。

2.权利1所述的精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法，其步骤包括：

 选用pET质粒作为表达载体、大肠杆菌作为宿主菌；

 选用两种合适的核苷酸内切酶，重组构建表达质粒，再转入宿主菌筛选重组表达精氨酸脱亚胺酶菌株；

重组表达菌株在一定的培养基中一定温度下培养，经诱导剂诱导表达重组精氨酸脱亚胺酶。

3.权利要求2所述的精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法，其特征在于，步骤所述的质粒载体，优选为pET-3c。

4.权利要求2所述的精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法，其特征在于，步骤所述的大肠杆菌宿主菌为E.coli BL21、E.coli BL21（DE3）、E.coli BL21（DE3）plysS，优选为E.coli BL21 (DE3)pLysS。

5.权利要求2所述的精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法，其特征在于，步骤所采用的培养基为LB、M9CA、M9-YE-Glu培养基。

6.权利要求2所述的精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法，其特征在于，步骤所采用的培养温度范围为26℃～37℃,优选为37℃；采用的诱导时间为2~5h。

7.权利要求2所述的精氨酸脱亚胺酶的重组表达方法，其特征在于，步骤所述的诱导剂为乳糖、半乳糖或IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），优选IPTG。

8.权利要求1所述的精氨酸脱亚胺酶的复性方法，其特征在于，采用尿素做为变性剂，包括以下步骤：

   将重组精氨酸脱亚胺酶表达的包涵体用含还原剂的高浓度尿素，按一定比例变性溶解；

  在一定温度下，将碱性复性稀释液按一定比例加入尿素变性溶解液中；

   将步骤中用复性稀释液稀释后含重组精氨酸脱亚胺酶复性溶液，在一定温度下进行足够时间的复性反应。

9.权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤中所用的尿素浓度为6M~10M。

10.权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤中所述的还原剂为二硫苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇或半胱氨酸，优选10mM的二硫苏糖醇。

11.权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤中所述的碱性复性稀释液的pH值范围为8.0～11.0，优选为9.5。

12.权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤和步骤中所述的温度范围为10℃~20℃，优选15℃。

13.权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤所述的复性稀释比例范围为10:1~100:1，优选40:1；复性时间范围为12~96小时。