[发明专利]一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法

说明书

技术领域

本发明属于褶牡蛎细胞免疫学领域，特别涉及一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法。

背景技术

褶牡蛎(Ostrea plicatula)是我国南北沿海主要的养殖对象，近些年随着养殖规模的加剧以及养殖环境的恶化，渐趋出现了抗逆力减弱、免疫力下降、易发病等问题。这些问题目前尚无可行的解决办法，其主要原因是对贝类免疫防御机制的认知还不是十分清晰透彻。因此，亟需深入开展贝类免疫学相关的基础研究。

由于缺乏由免疫球蛋白介导的特异性免疫，贝类的免疫防御机制主要依赖于非特性免疫。血细胞是非特异免疫的主要执行者。血细胞通过聚集、吞噬、包囊、节结、氧化杀伤、黑化等一系列免疫过程达到识别、包裹和清除外来异物的目的。吞噬是血细胞最古老、最基本、最有效的防卫行为，也是最被认可的可用于评价贝类免疫力强弱的指标之一。贝类血细胞根据胞质颗粒有无可分为透明细胞和颗粒细胞，研究表明颗粒细胞较透明细胞更具吞噬力。颗粒细胞又可根据胞质酸碱性分为嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，尽管在少数贝类中也发现了嗜中性粒细胞的存在。关于嗜酸性和嗜碱性粒细胞的研究，目前多集中于形态和染色亲和性方面，至于免疫功能特别是吞噬力方面，报道甚少。

关于这两类粒细胞吞噬力研究缓慢的原因主要受限于适宜研究方法的缺乏。目前用于分析细胞吞噬力的方法常见的有两种：一是以荧光微球为吞噬介质的流式细胞仪检测法，二是以细菌/酵母为吞噬介质的吉姆萨染色镜检法。虽然荧光微球具有粒径均一，特异性强，稳定性高等特点；流式细胞仪具操作简单快速、结果可靠等特点，但考虑到贝类嗜酸性和嗜碱性粒细胞往往具相近的细胞大小(cell size，FSC)和胞质颗粒度(cytoplasmic granularity，SSC)，使得在流式散点图中很难将这两类粒细胞清晰地区分开来，即流式细胞仪在检测这两类粒细胞的吞噬力方面存在局限性。吉姆萨染色法虽然可以清晰地区分嗜酸性(胞质红色)和嗜碱性(胞质蓝色)粒细胞，但胞质中吞噬的细菌也极易上色，造成与胞质颗粒的混肴，特异性差；另需培养灭活细菌，耗时长，重复性低。

中性红(Neutral red)是一种对细胞无毒害的活体染料，只有活细胞才能着色。中性红通过离子扩散渗入到活体细胞质中，遇酸性物质变红，遇中性或弱碱性物质不变色或变淡黄色，即染色后无论是嗜酸性粒细胞还是嗜碱性粒细胞，其细胞核因核酸缘故都会变红；而胞质方面，嗜酸性粒细胞变淡黄色，而嗜碱性粒细胞变红。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法，该方法具有操作简单、快速、准确、特异性强、重复性高等优点。

本发明的一种用于检测褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞吞噬力的方法，包括：

(1)取褶牡蛎，从闭壳肌中抽取血淋巴与抗凝剂混匀，离心后PBS重悬血细胞沉淀，并调节细胞浓度，得到褶牡蛎血细胞悬液；

(2)将步骤(1)的血细胞悬液与荧光微球处理液混匀，35～40℃避光孵育1～2h；离心、洗涤、重悬，得到吞噬后的血细胞悬液；

(3)将步骤(2)的血细胞悬液与中性红染液混匀，室温避光染色30～40min；离心、洗涤、重悬，得到中性红染色后的血细胞悬液；

(4)将步骤(3)的血细胞悬液与丙酮混匀，室温固定5～10min；离心，去除上清液，血细胞沉淀用碘化丙啶溶液重悬，室温孵育15～20min；离心、洗涤、重悬，得到碘化丙啶衬染的血细胞悬液；

(5)取步骤(4)的血细胞悬液滴加于载玻片上，分别观察吞噬细胞和吞噬微球，拍照，统计吞噬细胞数和吞噬微球数分析褶牡蛎嗜酸性和嗜碱性粒细胞的吞噬力。

所述步骤(1)中的抗凝剂的组成为葡萄糖20.8g，柠檬酸钠8.0g，EDTA3.36g，氯化钠22.3g，蒸馏水1000ml，pH7.2。

所述步骤(2)中的荧光微球处理液的制备方法为：荧光微球悬液与3.0％牛血清白蛋白溶液按体积比1:100混匀，室温避光超声处理15～20min。

所述步骤(3)中的中性红染液的制备方法为：用磷酸盐缓冲液PBS将中性红按质量比100:1溶解，经滤纸过滤后即得中性红储备液；使用时，将储备液用PBS作10倍稀释。

所述步骤(2)、(3)和(4)中的洗涤和重悬采用PBS。

所述步骤(4)中的碘化丙啶溶液浓度为0.5mg/ml。

所述步骤(5)中的拍照是通过原位拍摄明视野和荧光视野，其中荧光视野是通过将蓝色和绿色荧光视野的照片叠加而成。