[发明专利]适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因及其表达系统和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因，还涉及含有该基因的表达系统和应用。 

背景技术

进入21世纪以来，随着人类对医用、药用、食用、美容、保健等各种用途的功能性蛋白需求量的日益增大，依靠提取、生产天然来源的蛋白质已无法满足快速增长的市场需求。建立和完善各种高效的原核和真核表达系统，利用大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、昆虫以及哺乳动物等作为宿主生物反应器，是实现低成本、规模化生产具有生物学活性的重组外源蛋白的有效和可持续方法，并成为当今世界研究的热点。利用中国仓鼠卵巢细胞作为生物反应器生产外源蛋白是目前最为标准的表达模式，但其运营成本和对环境的要求极为苛刻，严重限制了其大规模推广应用。为了建立低成本、规模化、安全可持续的高效生产外源蛋白的生物工厂，自2000年以来，科研人员开始尝试利用转基因生物，如哺乳动物、鸟类、昆虫以及植物的器官作为生物反应器来生产重组外源蛋白。 

家蚕以泌丝著称，是最早被人类所完全驯化利用的经济动物(昆虫)之一。家蚕的丝腺是合成、分泌蚕丝蛋白的器官，是整个蚕丝业的生物学基础。经过数千年的人工驯化，家蚕的丝腺具备了超强的蛋白质合成与分泌能力，一头体重5g左右家蚕能合成分泌约0.5g蚕丝蛋白，为目前已知昆虫之最。蚕丝蛋白主要由丝素蛋白(fibroin)和包裹在其外层的丝胶蛋白(sericin)构成：丝素蛋白是蚕丝的主体，约占75％，由蚕的后部丝腺合成，主要包括丝素重链(FibH chain)、丝素轻链(FibL chain)和丝素P25三种；其余的25％为丝胶蛋白，由蚕的中部丝腺合成，包括丝胶1(Sericin1)、丝胶2(Sericin2)和丝胶3(Sericin3)三种主要组分，其中又以丝胶1蛋白含量最高，均可溶于水。随着现代分子生物学和转基因技术的发展，家蚕绢丝腺的高效合成与分泌丝蛋白这一特征，以及所具备的糖基化、甲基化等对外源蛋白保持活性极其重要的蛋白质翻译后修饰加工能力，饲养成本低，可工厂化生产，对人畜安全等特点，使其成为理想的生物反应器模型，备受各国研究人员关注并竞相开发利用。 

2000年，田村等人利用pBac转座子介导显微注射家蚕蚕卵并获得了稳定遗传的转基因家蚕；2003年，夏庆友等人完成了家蚕基因组计划，家蚕丝腺中涉及丝蛋白合成的重要编码 基因如丝素重链(FibH chain)基因、丝素轻链(FibL chain)基因、丝胶1(Sericin1)基因、丝胶2(Sericin2)基因、丝胶3(Sericin3)基因以及丝素P25基因等的启动子调控元件被克隆，同时对表达系统进行优化，获得了高效的转基因家蚕丝胶1表达系统。这些基础研究结果使得利用转基因家蚕组织特异表达系统，在丝腺中大规模生产重组外源蛋白成为可能。 

人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF)是肝素结合蛋白，属于成纤维细胞生长因子家族成员，具有促进有丝分裂的活性，具有广泛临床医学应用价值，在医学上，aFGF(FGF1)主要外用于创口的愈合，它可以促进受损部位血管的恢复和重建，恢复和重建受损组织的功能，增强受损部位抗感染能力，提高受损部位愈合后的强度和弹性，减少疤痕的形成，显著缩短修复时间。主要应用于烧伤、外科创伤、难愈性体表溃疡、口腔粘膜糜烂等疾病的治疗。此外aFGF在美容应用方面，它能平衡色素分布改善肤色肤质，加速各种美容整形手术后皮肤创伤的修复，平皱保湿，增加皮肤弹性。在美容护肤品中添加一定量的酸性成细胞生长因子可以随时补充肌肤细胞必要的营养成份，保持肌肤细胞旺盛的活力，维持肌肤细胞弹性及光彩，抵抗肌肤老化，平衡肌肤细胞的分泌状态，抑制暗疮粉刺的形成，使皮肤光滑红润。根据世界卫生组织(WHO)的统计，中国大陆的烧烫伤药每年约有100～200万剂的需求量，总市值约3～5亿美元；全球市值估计在10亿美元至15亿美元。因此，急需一种能够大规模生产具有活性的重组haFGF的方法，具有高效率、低成本的特点，具有巨大的市场开发前景。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因；本发明的目的之二在于提供含有改造人酸性成纤维细胞生长因子基因的表达系统；本发明的目的之三在于提供表达系统在家蚕丝腺表达重组人酸性成纤维细胞生长因子中的应用；本发明的目的之四在于提供表达系统在家蚕丝腺中表达人酸性成纤维细胞生长因子的方法。 

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：