[发明专利]适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因及其表达系统和应用

权利要求书

1.适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因，其特征在于：所述改造人酸性成纤维细胞生长因子基因如SEQ ID NO.1第7-450位所示。

2.根据权利要求1所述适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因，其特征在于：所述改造人酸性成纤维细胞生长因子基因编码的氨基酸如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1或2所述适于家蚕丝腺表达的改造人酸性成纤维细胞生长因子基因的表达系统。

4.根据权利要求3所述的表达系统，其特征在于：所述表达系统含有顺序连接的增强子hr3，分泌型丝胶1基因启动子、改造人酸性成纤维细胞生长因子基因、丝胶1基因的终止子和piggyBac转座序列。

5.根据权利要求4所述的表达系统，其特征在于：所述表达系统还含有荧光筛选标记基因表达框，所述荧光筛选标记基因表达框位于所述增强子hr3上游。

6.根据权利要求5所述的表达系统，其特征在于：所述表达系统为如SEQ ID NO.3所示的序列通过AscI酶切后连入pBac[3×p3EGFPaf]载体的AscI位点而得。

7.权利要求3-6任一项所述表达系统在家蚕丝腺表达重组人酸性成纤维细胞生长因子中的应用。

8.利用权利要求3-6任一项所述表达系统在家蚕丝腺中表达人酸性成纤维细胞生长因子的方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述表达系统转化解除滞育家蚕蚕卵，用无毒胶水封口后经甲醛蒸汽消毒，孵化，筛选转基因阳性蛾圈，取阳性转基因家蚕茧壳，在液氮中粉碎成粉末，然后溶解于含20mM Tris-Cl，8M Urea，pH7.0的缓冲液中，离心收集上清，经镍离子亲和层析柱纯化，得重组人酸性成纤维细胞生长因子。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：茧壳粉末溶解于缓冲液后茧壳粉末的浓度为20mg/mL。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述纯化的具体方法为：将离心收集的上清流过镍离子亲和层析柱，然后分别用0mM，20mM，40mM咪唑的萃取缓冲液对柱子进行梯度漂洗，随后用120mM咪唑的萃取缓冲液进行柱洗脱，并收集各组分的流出样品，将洗脱组份样品倒入1kDa分子量截留的透析袋中，置于含20mM Tris-Cl，pH7.0的缓冲液中于4℃透析24h，期间每6h更换透析缓冲液一次，再将透析袋放入含2.0mM GSH、0.2mM GSSG、1mM DTT和20mM Tris-Cl、pH7.0的复性缓冲液中进行透析复性24h，最后利用含20mM Tris-Cl，pH7.0的缓冲液中于4℃透析48h，期间每隔6h更换一次透析缓冲液。