[发明专利]一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法

权利要求书

1.一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a)菌种活化与增殖培养：将嗜热链球菌菌种接种到M17液体培养基中活化，将已活化的菌种接种于增殖抗冻培养基中增殖培养，得到增殖的菌液；

b)收集菌体：将上述增殖的菌液离心处理，弃去上清液，得到菌泥；

c)干燥：在所制备的菌泥中按每克菌泥添加0.14-0.2g蔗糖、0.12-0.18g可溶性淀粉、0.002-0.004g Vc、0.5-1.0mL的磷酸缓冲液、0.1-0.3g薏苡仁和山药混合多糖提取物，混合均匀后真空冷冻干燥，即得嗜热链球菌冻干菌粉；

所述増殖抗冻培养基配方组成为：10-20g葡萄糖、10-25g大豆蛋白胨、5-10g酪蛋白水解物、0.005-0.010mg谷氨酸、2-4g KH₂PO₄、0.5-1mL吐温80、白扁豆多糖0.2-0.5g、蒸馏水1000mL。

2.根据权利要求1所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述步骤a)中活化是指将嗜热链球菌菌种接种到M17液体培养基中于35-38℃培养22-26h，再按每100mL培养基中接种2-5mL菌种的比例，接种于与上述M17液体培养基相同的培养基中，并在相同条件下活化至第三代。

3.根据权利要求2所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述步骤a)中增殖培养的接种比例为每100mL增殖抗冻培养基中接种2-5mL已活化的菌种。

4.根据权利要求3所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述步骤a)中增殖培养是于35-38℃下培养16-18h。

5.根据权利要求1至4任意一项所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述培养基均已灭菌，且所述增殖抗冻培养基经过118-121℃、15min灭菌处理并室温冷却。

6.根据权利要求1所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述白扁豆多糖的制备步骤包括：

首先将5份干燥的白扁豆粉碎后浸泡于100-150份蒸馏水中，调节pH值至5.0-6.8；

其次在40-55℃的水浴温度下加入白扁豆质量0.5-2％、活力为8000-10000U/g的纤维素酶和白扁豆质量1-2％、活力为20000-30000U/g的果胶酶，保温1.5-2.5h后加热至沸腾，再保温15-20min；

然后抽滤并将滤液浓缩，向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，静置10-14h后抽滤，所得滤渣于45-55℃烘干，即得白扁豆粗多糖；

最后取干燥的白扁豆粗多糖溶于水浴加热至50-70℃的蒸馏水中，按每0.5g白扁豆粗多糖溶于15-20mL蒸馏水的比例计算，得到多糖溶液，在多糖溶液中加入白扁豆粗多糖质量1-4％的木瓜蛋白酶，酶解0.5-1h后得酶解液，酶解液使用多糖溶液15-25％体积的Sevag试剂除蛋白20-30min；2000-4000rpm离心15-20min后取上清液，反复离心处理三次，得到的上清液经真空冷冻干燥后即得白扁豆多糖。

7.根据权利要求1所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述步骤b)中离心处理为0-4℃、8000-10000rpm离心15-20min。

8.根据权利要求1所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述薏苡仁和山药混合多糖提取物的制备步骤包括：

首先将5份干燥的薏苡仁和去皮的山药混合物粉碎后浸泡于150-200份蒸馏水中，其中薏苡仁和去皮的山药按1:1混合，调节pH值至6.0-7.0，在80-100℃水浴温度下提取1-2h，冷却至40-55℃；

接着在40-55℃水浴下加入占上述薏苡仁和去皮的山药混合物质量1-2.5％的果胶酶和0.8-1％的α-淀粉酶，并保温1.5-2.0h后加热至沸腾，再保温10-15min；

然后抽滤并将滤液浓缩，向浓缩液中加入3-4倍体积的95％乙醇，静置10-14h后抽滤，所得滤渣即为粗混合多糖；

最后用80％乙醇溶液洗涤粗混合多糖，过滤后将所得沉淀于45-55℃烘干，即得薏苡仁和山药混合多糖提取物。

9.根据权利要求1所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述步骤c)中真空冷冻干燥是在冻干机中进行18-24h。

10.根据权利要求1或9所述的一种嗜热链球菌冻干菌粉制备方法，其特征在于：所述步骤c)中真空冷冻干燥之前在-40℃预冻6-14h。