[发明专利]多功能模块融合蛋白及其在提高蛋白质类药物口服生物利用度中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术制药及基因工程技术领域，具体涉及一种具有蛋白质类药物分子、pH依赖组装-去组装肽、特定酶解位点肽、连接肽和小肠闭锁开启肽五种功能模块的多功能模块融合蛋白，通过口服该多功能模块融合蛋白，可以提高蛋白质类药物口服生物利用度。

背景技术

蛋白质多肽类药物（如胰岛素、肿瘤抑制因子、降钙素等）在临床的应用越来越多，他们具有较好的发展前景。目前，蛋白质多肽药物主要是通过注射方式进行给药，频繁给药给患者带来不便于痛苦。口服给药时最简单和最方便的形式，患者也更易于接受口服剂型药物，可以用口服给药替代注射给药的方式进行给药。目前国内外市场上的蛋白质多肽药物主要是有环孢菌素A、去氨加压素、胸腺肽等。通常蛋白质多肽的口服给药的生物利用度低于1%，这限制了蛋白质多肽药物口服给药的研发。

蛋白质多肽类药物口服生物利用度低主要与如下因素有关：小肠黏膜上皮细胞屏障、蛋白酶解、环境pH值变性及肝的首过作用。下面对这些因素分别进行分析与阐述：

1小肠黏膜上皮屏障：人体内小肠黏膜上皮细胞间孔径为0.4nm，只能通过氨基酸、二肽、三肽，蛋白质多肽药物分子分子量较大、脂溶性差，难于透过膜孔进入血液循环。

为解决这一难题，目前人们主要采用Ca²⁺和Zn²⁺离子螯合剂降低肠道内这两种离子的浓度，使得肠道黏膜细胞之间的紧密连接开放，蛋白质多肽类药物分子可以再肠道黏膜细胞间紧密连接开放时穿过肠道黏膜进入血液，从而提高其生物利用度。

Fasano等人发现闭锁小带毒素蛋白可以作用于闭锁小带的肌动蛋白增加整个肠道细胞紧密连接的通透性，在不损害整个小肠的完整性与功能的前提下提高蛋白质多肽药物透过小肠黏膜的能力，闭锁小带毒素蛋白仅对小肠和十二指肠的受体有效而不作用于直肠和结肠，不影响全肠道功能的完整性或功能，它的细胞内作用具有时间、剂量依赖性和部位限定性，是安全可逆的。他们发现当闭锁小带毒素蛋白与目标蛋白质药物分子以5：2或2：1的比例物理混合时，实验动物呈现最大的蛋白质药物生物利用效率。

2酶解与酸性：胃酸pH值在1～2.5之间，许多肽类药物在这种条件下失去其生物活性，胃蛋白酶在此条件下可以降多数肽类药物降解成序列较短的肽，后者进入肠道后进一步被胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶等多种酶降解成小分子氨基酸，降解后肽类药物时期其生物活性。

为解决这一难题，目前人们主要使用聚丙烯酰胺衍生物卡波姆、聚卡波菲对消化道酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶等）的抑制效果，研究表明卡波姆和聚卡波菲是通过竞争性结合上述消化道酶执行其生物活性所必须的二价阳离子Zn2＋和Ca2＋来实现抑制这些消化道酶活性的。

3首过效应和吸收部位：肝脏、肠道的刷状缘、肠皮细胞溶酶体均参与首过效应，胆汁内容物、胃肠道表面的黏液层和不流动水层的机械屏障作用以及肽类药物自身构象的不稳定性都是导致多肽药物口服生物利用度低的原因。

为了解决这些因素的影响，人们对多肽药物的亲脂性、电荷数、等电点、分子大小、化学稳定性以及载体的亲和力等等进行了改造。如：利用VB12与10个氨基酸残基一下的小肽连接，提高药物的通过受体介导促进吸收；利用脂类诸如胆酸、脂肪酸修饰多肽，提高多肽药物的脂溶性增加肽类与Caco-2细胞结合从而提高药物的口服利用率和生物利用度；将多肽药物与大分子如蛋白质和其它聚合物结合，在不改变上皮细胞机能的前体下提高药物分子的吸收。

除了对药物分子自身结构进行改造外，人们还对药物组成和配方进行了调节，比如在药物中添加吸收促进剂和酶抑制剂，这一研究领域主要是通过调整多肽药物的渗透性和可消化性来改善药物自爱胃肠道的吸收状况，具体内容在前文已经有所叙述。

除了上述两点，人们还对药物进行了剂型研究：利用高分子物质做肠溶衣在口服多肽类药物中应用较为广泛。用Eudragit S100、用偶氮聚合物、马酸－乙交酯－丙交酯共聚物、壳聚糖及其衍生物等聚合物在蛋白质药物口服给药的研发中起到了显著的效果；

结肠定位给药技术，利用结肠面积大，药物停留时间长，蛋白水解酶含量低等优点，开发pH依赖型和时滞型定位给药系统。

发明内容