[发明专利]一种应用于核酸扩增实时电化学pH检测的反应体系和检测方法

说明书

技术领域

本发明属电化学分析、核酸分析领域，涉及应用于核酸扩增实时电化学pH检测的反应体系。

背景技术

核酸扩增技术被广泛应用在农业、医学及食品工业领域，特别是医疗诊断及食品安全检测方面。由于传统DNA扩增需要有单链模板的产生、引物与模板的结合以及引物的延伸等循环，需要有变性（95℃）、退火（55~60℃）、延伸（72℃）等步骤；而且DNA扩增的实时检测常常依赖于荧光染料，因此对仪器的温度控制精度有较高要求并且需要较庞大的光学检测设备，从而限制了实时核酸扩增技术的成本和应用范围。恒温扩增技术是近年发展起来的一类新型扩增技术，由于能够在恒定温度条件下实现核酸扩增，因此不需要使用昂贵的、精密控制温度的 PCR仪器、消耗大量电力，从而得到广泛关注。其中发展较快的有交叉引物恒温扩增技术（CPA）、环介导恒温扩增技术（LAMP）等等。尽管恒温扩增技术摆脱了精密的温控设备，但仍然需要复杂、庞大的光学设备对其扩增产物进行实时检测。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种应用于核酸扩增实时电化学pH检测的反应体系。为此，本发明采用以下技术方案：

一种应用于核酸扩增实时电化学pH检测的反应体系，其为恒温扩增反应体系，含有引物、反应液、DNA聚合酶、和待检DNA；所述反应体系中的反应液含有Triton X-100、dNTP、甜菜碱、Mg²⁺、K⁺与NH₄⁺，其特征在于所述反应体系的反应液中有额外添加的OH^-。

在采用上述技术方案的基础上，本发明还可采用以下进一步的技术方案：

所述反应体系的反应液中K⁺的工作浓度在50mM。

所述反应体系的反应液中K⁺主要由KCl或K₂SO₄提供，KCl的工作浓度在22-48mM，K₂SO₄的工作浓度在11-24mM。

所述反应体系的反应液中OH^-由KOH提供，所述反应液中KOH的工作浓度在2-8mM。

所述的反应液中NH₄⁺的工作浓度在10-60mM。

所述的反应液中NH₄⁺ 由(NH₄)₂SO₄或NH₄Cl提供。

所述DNA聚合酶为具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶，GspF DNA聚合酶。

本发明的第二个目的是提供一种基于核酸扩增中pH变化的电化学传感器实时监测恒温扩增的方法。为此，本发明采用以下技术方案：

一种基于核酸扩增中pH变化的电化学传感器实时监测恒温扩增的方法，其特征在于它包括以下步骤：

（1）、提取待检样品核酸；

（2）、在反应管中配置权利要求1所述的反应体系；

（3）、扩增反应：将配置好反应体系的反应管混匀后，油封，并插入电极，于60-65℃水浴或金属浴反应50min；

（4）、通过电极连接的数据窗口实时读取pH数据。

所述待检样品可以为DNA，也可以为RNA，如果待检样品为RNA，则需通过逆转录为DNA后进行检测。

所述油封是指在反应液表面滴加20-50ul油，所用油可以是矿物油或者石蜡油。

所述电极是对pH敏感的电极，例如8220 BNWP Thermo ROSS Ultra 复合电极，也可以是其他对pH敏感的电化学传感器。

本发明所提供的检测方法可用于交叉引物恒温扩增（CPA）的产物检测，其引物包含有：正向外围引物、反向外围引物、正向交叉引物、反向交叉引物、正向检测引物和反向检测引物。本发明所提供的检测方法同样适用于其他核酸恒温扩增产物检测。

电化学传感器具有检测灵敏度高、选择性好、响应快速等特点，目前已被广泛用于医药、临床、工业和食品化学等领域的分析与检测。pH计作为一种应用最为广泛的电化学传感器，因其价格低、易于微型化和集成化等特点，具有巨大的发展潜力。