[发明专利]一种DNA修饰的金纳米比色传感器，及其制备方法以及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及金胶溶液比色传感器的制备及其对叶酸受体的检测。

背景技术

叶酸受体(FR)在生理、药理及细胞病变进程中具有的至关重要的作用，因此直接选择性的检测FR在恶性肿瘤中的表达具有重要意义。过去20年中，荧光共振能量转移(FRET)、荧光各向异性、毛细管电泳(CE)、表面等离子体共振(SPR)等是最常用的检测FR的方法。然而，这些方法固有的缺陷，如要求昂贵的、复杂的仪器，限制了其发展成为实时检测FR的重要手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA修饰的金纳米比色传感器，及其制备方法以及用途。本发明使用化学还原法合成了金纳米粒子，利用金硫键将修饰了巯基的DNA(S1)修饰到粒子表面制备S1-Au NPs。FR可与叶酸(FA)特异性结合形成FR-FA，使FA修饰的DNA(FA-DNA)不被核苷酸外切酶-I(Exo I)所水解，从而达到保护FA-DNA的目的，利用此性质及DNA序列之间碱基的互补配对原则，构建了S1-Au NPs比色传感器并实现了直接选择性的检测FR。

具体技术方案如下：

一种DNA修饰的金纳米比色传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)将DNA序列(巯基化：S1、FA-DNA:S2)分别溶解在Tris-HCl缓冲溶液中，并保存备用；

(2)将FA结合到3’端修饰氨基的S2上；

(3)一定浓度S2与Tris-HCl缓冲溶液以一定比例混合均匀后于黑暗中培养数小时；

(4)此FA-S2溶液在PBS缓冲溶液中进行透析，分离多余的FA；

(5)将FR加入到上述透析过的溶液中，黑暗中再培养一段时间；

(6)加入ExoI于上述混合溶液中，水解完成后S2/FA-FR形成；

(7)将S1-AuNP与步骤(6)中S2/FA-FR溶液混合均匀，振荡以得到较稳定的溶液。

进一步地，步骤(1)中Tris-HCl缓冲溶液pH7.4，并在4℃下保存备用。

进一步地，步骤(2)中使用琥珀酰亚胺耦合法EDC-NHS将FA结合到3’端修饰氨基的S2上。

进一步地，步骤(3)中Tris-HCl缓冲溶液的pH7.4，含10mMFA，1mMEDC，5mMSulfo-NHS，且于37℃黑暗中培养；和/或，步骤(3)中，0.5mL20μMS2与0.5mL100mMTris-HCl缓冲溶液混合均匀后于37℃黑暗中培养3h。

进一步地，步骤(4)中缓冲溶液pH7.4，多余的FA分子量筛截：1000Da。

进一步地，步骤(5)中FR为标准系列浓度，37℃黑暗中培养2h，和/或步骤(6)中加入400U/mLExoI，和/或水解30分钟。

进一步地，步骤(7)中，400μLS1-AuNPs与200μL步骤(6)中S2/FA-FR溶液混合均匀，轻轻振荡5分钟以得到较稳定的溶液，然后将此溶液与黑暗中培养2h后得到系列标准比色溶液；和/或，步骤(7)中S1-AuNPs的制备采用：利用化学还原法，先合成出尺寸均匀的AuNPs分散溶液，再将有巯基修饰的DNA-S1修饰到粒子表面。

一种DNA修饰的金纳米比色传感器，其由上述的方法制备得到。

上述金纳米比色传感器的用途，基于尾端保护比色检测叶酸受体。

上述金纳米比色传感器的用途，适用于FR的可视实时检测，检测范围约为0.5to50μg/mL。

与目前现有技术相比，本发明所述的比色传感器制备简单，耗能低，选择性高，快速且可视化，适用于FR的实时检测，可望应用于临床诊断。金纳米粒子上的S1与FR保护的S2/FA之间的杂交引发金纳米离子的聚合，使得溶液颜色发生从酒红色到深蓝色的明显变化，因此可达到用肉眼检测FR浓度的目的。所制备比色体系，检测范围约为0.5to50μg/mL。此比色体系产物稳定，制备过程简单，价格不高，可望用于医疗资源匮乏的偏远地区细胞中FR浓度的检测。这不仅仅是简单的通过检测FR来为癌症治疗提供了一条潜在途径，更是开阔了联合治疗法的发展前景。

附图说明

图1为比色传感器可视检测FR原理图；

图2(a)为制备的Au NPs的SEM图；

图2(b)为紫外吸收光谱,a为金纳米粒子的紫外吸收光谱，b为S1修饰的金纳米粒子的紫外吸收光谱；