[发明专利]O-烷基氨基甲酸酯壳聚糖、转基因复合物微粒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因复合物微粒的载体及一种三元转基因复合物微粒，具体地说，涉及一种脂质体-聚合物-DNA三元转基因复合物微粒，及其制备方法，属于基因治疗领域新型高效非病毒基因载体的制备方法与技术。

背景技术

基因治疗通过将外源基因导入到靶细胞核内以修复导致疾病的缺陷基因或者抑制导致疾病的有害基因，从而使机体恢复正常功能，达到治疗疾病的目的。分子生物学的发展和人类基因库的建立推动了基因治疗的临床应用，使其不仅在治疗遗传性先天疾病和恶性肿瘤等领域发挥优势，并且越来越广泛的应用于各种普遍性疾病的治疗。基因治疗的关键在于开发安全、高效的基因递送载体【1.生物技术通报，2010，2，38-40，基因治疗导入载体的研究进展】。

基因递送载体分为病毒和非病毒载体两类。近年来，非病毒载体由于免疫原性低、携带基因能力强、易于批量生产等优点得到快速发展。非病毒基因载体主要包括脂质体和阳离子聚合物如壳聚糖、聚乙烯亚胺等。壳聚糖是一种天然阳离子碱性多糖，具有良好的生物降解性、生物相容性、低细胞毒性等优点，其所携带的氨基阳离子能够复合DNA形成纳米微球，正成为非病毒基因载体的热门研究内容之一。但壳聚糖转染效率低【2.J.Controlled Release,2001,70,399-421.Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers:synthesis,characterization and transfection efficiency】。为了提高壳聚糖的基因转染效率，研究人员进行了大量的壳聚糖改性修饰研究【3.Prog.Polym.Sci.,2007.32,726-753.Chemical modification of chitosan as a gene carrier in vitro and in vivo】。其中N-烷基化壳聚糖非病毒基因载体具有亲疏水性可调、细胞毒性低、转染效率高等优点【4.中国发明专利，专利公开号CN1386548A，20021225，烷基化壳聚糖转基因复合物微粒的制备方法】。

文献报道的壳聚糖烷基改性直接修饰壳聚糖氨基，而壳聚糖氨基是提供其生物活性功能最重要的官能团，而且文献报道烷基修饰壳聚糖对DNA的压缩更紧密，不利于复合物进入细胞之后DNA的释放【5.Bioconjugate Chem.2003,14,782-789,N-Alkylated Chitosan as a Potential Nonviral Vector for Gene Transfection.】。从目前文献的调研结果看，尚未有任何报道不占用壳聚糖氨基对壳聚糖进行进入细胞后易断裂烷基改性修饰，并将之复合成转基因复合物微粒进行运用。

发明内容

为解决现有技术中存在的壳聚糖烷基改性直接修饰壳聚糖氨基，占用其生物活性重要基团的问题，提供一种O-烷基氨基甲酸酯壳聚糖的制备方法，先采用邻苯二甲酰亚胺化将壳聚糖的氨基保护，再进行烷基改性，最后进行脱氨基保护，制备出一种O-烷基氨基甲酸酯壳聚糖基因载体，本发明还提供一种三元转基因复合物微粒及其制备方法，本发明的O-烷基氨基甲酸酯壳聚糖是一种高效低毒的非病毒基因载体。

本发明的技术目的通过以下技术方案实现：

一种O-烷基氨基甲酸酯壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：

①壳聚糖氨基的邻苯二甲酰亚胺化：将壳聚糖与邻苯二甲酸酐反应生成邻苯二甲酰亚胺；

②壳聚糖与烷基胺的偶联：将步骤①得到的邻苯二甲酰亚胺分散到无水N-甲基吡咯烷酮中，再加入偶联剂，偶联剂与壳聚糖重复单元的摩尔比为0.1-2:1，所述偶联剂选自羰基二咪唑、光气和碳酸二甲酯中的一种，在常压、氮气气氛下于30-80℃搅拌反应1-5h，再加入C₈-C₂₀的直链烷基胺，与壳聚糖重复单元的摩尔比为0.1-2:1，常压、氮气气氛下于30-80℃搅拌反应1h-5h，得到反应液；

③反应物中氨基的脱保护：在步骤②的反应液中加入无水乙醇，抽滤，收集沉淀，再加入水合肼溶液和甲醇的混合液，回流，脱去邻苯二甲酰基团，收集产物，通过索氏提取进行纯化，再经过真空干燥得到终产品。

本发明所述的制备方法，步骤①的壳聚糖优选重均分子量为2-10万，脱乙酰度为65％-95％。