[发明专利]pH选择性抗肿瘤多肽及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效pH选择性抗肿瘤多肽及其应用，属于抗肿瘤药物研发与应用技术领域。 

背景技术

肿瘤的多药耐药性一直是困扰癌症治疗的一个重大障碍。而高效抗癌多肽，作为一种直接强效破坏肿瘤细胞的候选药物，由于其特殊的作用机理，不易发生肿瘤耐药性，正受到越来越多的关注。高效特异的抗癌多肽的设计是学术界公认的热点。开发具有药用价值的抗肿瘤多肽具有广泛的市场前景。然而，抗癌多肽也有自身的局限性，主要是选择性差。本发明设计了一系列的具有pH值选择性的抗癌多肽，显著增加了高效抗癌多肽的选择性。该项研究，对于癌症治疗，学术成果产业化都有着重要意义。 

生物活性多肽是一种有着特殊的生物功能的多肽。一些比较成功的多肽药物包括控制糖尿病的胰高血糖素样多肽1 (GLP-1)；用来治疗肥胖的脑肠肽（ghrelin）；用来治疗癌症的胃泌激素释放多；及用作抗微生物的防御素。由于技术的局限性，以往多肽药物的研发多数仅限于研究领域，真正能走向临床的并不多。但随着近年来，生物技术的不断突破，以多肽为核心的新药层出不穷，并在临床上大显身手。多肽药物与传统小分子药物相比，有很多不同之处。首先，由于多肽是生物体内天然存在的物质，故毒性很小。其次，多肽药物一般不会像小分子药物那样富集在肝肾，对其产生毒副作用。而且，多肽与目标分子，例如靶蛋白，结合更紧密，故作用强大。 

人们通过实验发现许多实体瘤的细胞外pH值比正常组织要低。肿瘤组织的酸性主要来源于肿瘤脉管系统的混乱、肿瘤细胞增加的糖酵解、质子输出的增加、肿瘤组织间液缓冲能力的降低及扩散减缓等因素。基于这样的机理，设计具有pH值选择性的生物活性多肽，使之能区分正常组织和肿瘤；用这类多肽选择性地在酸性环境中杀死肿瘤细胞，而不影响生理pH条件下的正常组织。 

通过组氨酸取代设计pH敏感的裂解肽。在二十种常见氨基酸中，组氨酸由于它的特殊侧链，所以很特别。组氨酸的咪唑侧链的pKa值大约6.05，这意味着pH在6左右偏移很少一点就会改变它的电荷。实际上，多肽中组氨酸侧链的 pKa值和自由组氨酸的侧链略有不同。根据Bechinger的报告，基于不同的微环境，多肽的组氨酸侧链的pKa值在4.9到6.6之间（Burkhard, B., Unconventional concepts in environmental medicine. Versicherungsmedizin, 1996. 48(5): p. 179-84）。阳离子裂解肽靠多肽上的正电荷和靶细胞膜上的负电荷之间的吸引力结合到靶上。因此，一个含组氨酸的裂解肽，当环境的pH从中性变为酸性，多肽的电荷就可以朝正电方向变化，多肽将更易与靶细胞结合。另一方面，要抑制多肽在中性pH的活性。带正电的赖氨酸和精氨酸非常普遍，并且在阳离子裂解肽中起着关键作用，为了抑制多肽在中性pH的活性，可以减少多肽中赖氨酸和精氨酸的数量。在本发明中还发现，组氨酸取代赖氨酸和精氨酸对多肽构象有一定影响，并且这种影响对于提高多肽选择性有帮助。 

核糖体展示技术筛选膜裂解肽。核糖体展示技术（Ribosome Display）主要是在体外转录DNA为没有终止密码子的mRNA成库后，体外翻译mRNA形成核糖体-mRNA-蛋白复合物。这些复合物就可以以正确折叠的待筛选的多肽或蛋白来直接和固定的靶蛋白相互作用，再接合太弱的和非特异性结合的文库成分被洗去后，筛选出的复合物里的mRNA可以被洗脱和纯化。通过逆转录可进一步引入突变，产生出新的DNA库，富集更佳的结合产物，以供下一轮筛选。通过多轮重复筛选，从而最终在体外实现达尔文式的蛋白进化。核糖体展示和mRNA展示技术都具有建库容易、库容量大（10¹⁴）、通过随机的突变和选择来进化蛋白、分子多样性强等优点，是筛选大型文库和获取抗体和功能性多肽和酶的强有力的方法。 

发明内容

本发明的目的是提供一系列高效的具有pH选择性抗肿瘤多肽序列。 

    本发明所提供的多肽序列如表1.所示： 

    表1.  多肽的序列：

本发明采用核糖体展示技术筛选具有膜裂解和抗肿瘤活性多肽，具体技术方案如下：