[发明专利]一种用于羊传染性脓疱病毒分离培养和增殖的细胞系及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于羊传染性脓疱病毒增殖和疫苗制备的传代细胞系及其制备方法和应用，特别涉及新生牛睾丸支持细胞系及利用该细胞系增殖培养羊传染性脓疱病毒方法。本发明属于兽用疫苗制备技术领域。

背景技术

羊传染性脓疱病（Contagious ecthyma,CE）又名羊传染性脓疱性皮炎（Contagious pustular dermatitis），俗称“羊口疮（Orf）”，是由副痘病毒成员羊传染性脓疱病毒（Orf virus,ORFV）感染引起的山羊、绵羊和人的一种急性、接触性和嗜上皮性的人兽共患传染病，以在患羊的口唇、蹄、乳房、外阴等处皮肤和黏膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和疣状厚痂为特征。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为需申报类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。

该病最早发现于欧洲，目前，几乎所有养羊国家和地区均存在。近年来，羊传染性脓疱病在世界各养羊国家和地区的羊群中均有发生，被认为呈全球性流行的趋势。现有流行病学调查研究资料显示，该病发病率约为50％，而在敏感羊群中发病率则可达90％，因此，该病一旦发生，将给养羊户造成重大的经济损失，并严重危害肉羊产业的健康发展，更为严重的是此病可以通过伤口感染饲养人员，表现为感染者手背、指间和前臂部出现疱疹和破溃。例如2005年8月福建省永安市有8名羊场养殖工人因感染羊传染性脓疱病毒而发病。因此，羊传染性脓疱不但严重危害肉羊产业的健康发展，而且威胁人类的身体健康，是一种危害较为严重的人畜共患传染病。

目前，羊传染性脓疱病流行地区对此病尚无有效的治疗方法，所以，免疫接种成为了防控该病唯一有效的方法。在国内，虽然羊传染性脓疱弱毒疫苗在青海省畜牧兽医科学院兽医研究所和甘肃省畜牧兽医研究所均研制，但其制造工艺复杂、落后，繁殖羊传染性脓疱弱毒抗原必须用新生牛睾丸原代细胞，但制备这种细胞程序复杂，生产成本过高，生产效率较低下，这就给疫苗厂规模化生产羊传染性脓疱弱毒疫苗带来不便，企业也难以获得丰厚的利润。同时，每次繁殖羊口疮抗原所用的新生牛睾丸品种不一，这就很难使所生产的弱毒疫苗的质量保持稳定，此外，新生牛睾丸还有携带其他病原的潜在危险。因此，研发一种适于羊传染性脓疱病毒增殖的传代细胞系，对疫苗企业具有一定的现实意义。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明提出了一种用于羊传染性脓疱病毒分离培养和增殖，且同时能够用于羊传染性脓疱病疫苗制备的细胞系，该细胞系是通过对新生牛睾丸原代细胞进行分离和纯化后得到的一种新生牛睾丸支持细胞系。

在本发明中，优选的，所述的新生牛睾丸支持细胞系命名为新生牛睾丸支持细胞系NBSC，分类命名为新生牛睾丸支持细胞系，该细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：C201438。

本发明的一种用于增殖羊传染性脓疱病毒的新生牛睾丸支持细胞系是通过以下步骤制备得到的：

（1）新生牛睾丸组织收集、处理及消化；

（2）分离、纯化新生牛睾丸支持细胞。

其中，步骤（1）中新生牛睾丸组织来自健康母牛所生的1日龄未吃初乳的公牛；健康母牛口蹄疫、布氏杆菌病、副结核、牛病毒性腹泻检测为阴性；新生牛屠宰后采集阴囊（阴囊根部结扎，阴囊外部用75%酒精消毒）置恒温箱内，2小时内送回实验室。无菌分离睾丸实质用混合酶消化法制备细胞悬液。

其中，步骤（2）中分离纯化新生牛睾丸支持细胞所用方法为：将步骤（1）制备的细胞悬液按细胞浓度1～5×10⁵/ml分装到细胞瓶，进行反复差速贴壁法结合高温培养法进行分离纯化新生牛睾丸支持细胞。

其中，步骤（2）中新生牛睾丸支持细胞分离纯化培养所用的培养液为高糖DMEM细胞液或DMEM/F-12细胞培养液加2～10%胎牛血清，加青霉素、链霉素各100单位/ml，调PH至7.0～7.2。

进一步的，本发明还提出了一种羊传染性脓疱病毒的培养方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）选生长良好布满单层的新生牛睾丸支持细胞系，倾去营养液，按原营养液体积的5-15%接种羊传染性脓疱病毒液，吸附10-30分钟后加DMEM维持液，调PH至7.0～7.2，加青霉素、链霉素各100单位/ml，于37℃、5%CO₂浓度培养箱中进行培养；