[发明专利]一种基于DNAzyme探针的乙肝病毒检测方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种利用DNAzyme探针来进行定性和定量检测乙肝病毒DNA的方法。本发明针对现有技术的局限性，以PCR扩增为基础检测平台，通过引入3’‑氨基修饰的DNAzyme探针，实现了乙肝病毒的一步法定性及定量检测。该技术具有灵敏度高，特异性强，检测线性范围广，成本低廉，准确度高，方便操作等优点，为乙肝病毒提供了简单快速、准确高效、经济实用的检测方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于DNAzyme探针的乙肝病毒DNA定性及定量检测的方法。

背景技术

目前应用最为广泛的乙肝病毒DNA检测方法是实时荧光定量PCR方法，荧光定量PCR有很多优势，包括灵敏度高、特异性强，但是该技术需要依赖昂贵的荧光定量PCR仪和荧光探针，检测成本远远高于普通PCR，不利于大范围推广。因此，开发一种简单快速、准确高效、经济实用的乙肝病毒检测方法具有重要的社会意义和科研价值。

脱氧核酶(DNAzyme)是通过体外筛选技术获得的具有催化功能的单链DNA序列，迄今通过体外筛选已经获得多种具有不同催化功能的脱氧核酶，包括能够催化RNA剪切和链接、DNA的剪切和连接、DNA的磷酸化、卟啉的金属化、碳-碳键形成以及氧化等反应。DNAzyme除了具有多功能性，相对于蛋白酶和核酶，还具有合成简单、成本低、易保存、稳定性高等优势。目前，DNAzyme已在生物分析、医学诊断、纳米技术以及基因治疗等领域受到了广泛关注并取得一系列先进的研究成果。因此，基于DNAzyme的独特优势进行乙肝病毒检测方法的开发将有望突破现有技术的一些障碍，为乙肝病毒的检测提供更为经济实用的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单快速、准确高效、经济实用的定性和定量检测乙肝病毒的方法。

本发明具体涉及一种在PCR检测平台上利用DNAzyme探针对乙型肝炎病毒进行检测的方法。方法以乙肝病毒的基因保守区域为待检测的目标核酸序列进行PCR引物及特异性DNAzyme探针的设计。本发明所涉及的DNAzyme探针为一发夹探针，在常温条件、未检测到乙肝病毒时呈封闭的发夹状态，不显示DNAzyme活性，从而无检测信号产生；当用正反向引物对乙肝病毒S区保守序列即目标核酸序列进行扩增时，DNAzyme探针在PCR循环过程中可与目标核酸序列互补，并在引物延伸过程中由于核酸聚合酶5’-3’外切酶活性而被部分消化从而释放出DNAzyme探针中的活性DNAzyme序列。此时，被释放的活性DNAzyme序列便能发挥其活性产生多种可读的检测信号，如肉眼可见的颜色信号及可准确定量的光吸收信号、荧光信号等，从而报告检测结果。

本发明以乙肝病毒S区的基因保守区域设计了相应的引物和特异性DNAzyme探针的设计：（1）正向引物HBV-F:5’-CCTGGTTATCGCTGGATGTGT-3’；（2）反向引物HBV-R:5’-GGACAAACGGGCAACATACCTT-3’；（3）特异性的DNAzyme探针：5’-CCCTACCCATTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA-NH₂-3’。

本发明具体包括两个操作步骤：（1）PCR扩增目标核酸并释放活性DNAzyme序列；（2）比色/荧光报告检测结果。

与已有的相关检测技术相比，本发明所涉及的DNAzyme探针的3'-端进行了氨基修饰，使得目标核酸的检测可以一步完成，无需在PCR过程中再开盖加探针和补加引物便能获得非常好的检测信号，不仅使得操作过程更为简单，更重要的是避免了PCR过程中开盖将引起的交叉污染。此外，本发明在PCR反应中采用了UNG体系，避免扩增产物的污染，使得检测结果更为真实可靠，也降低了对操作环境的要求。