[发明专利]一种测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法

说明书

技术领域

本发明属于农业病害检测领域，具体涉及一种大批量、快速测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法。

背景技术

水稻是我国的第一大粮食作物，然而，近年来由水稻病毒引起的水稻病害在我国南方稻区大面积发生，已成为水稻生产上最严重的病毒病害，严重威胁到我国的粮食生产。

目前主要存在的水稻病毒有南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black streaked dwarf virus, SRBSDV）、水稻黑条矮缩病毒（Rice black streaked dwarf virus, RBSDV）、水稻矮缩病毒（Rice dwarf virus, RDV）、水稻齿叶矮缩病毒（Rice ragged stunt virus, RRSV）、水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus, RGDV）和水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV），这些侵染水稻的病毒均由介体昆虫如叶蝉和飞虱以持久增殖型方式传播。介体昆虫在感染病毒的水稻病株上取食后，病毒通过介体昆虫的口针进入消化道系统，并在昆虫体内增殖扩散，最后扩散到唾液腺，在昆虫取食时随唾液传到健康水稻。有的病毒还可以经卵传播给子代昆虫，子代昆虫又可以继续传播病毒，危害水稻。

正是由于介体昆虫的长距离或短距离迁飞特性，导致了水稻病毒在水稻种植区的扩散和大面积发生。然而目前还没有防治病毒病的有效药物，水稻一经感染病毒即无药可治，因此对田间介体昆虫的防治及带毒情况监测至关重要。由于水稻生长季节，田间分布着大量的介体昆虫，对不同地区不同时间段昆虫带毒率的检测是一项繁重的任务，且需要能尽快获得检测结果，及时指导农业生产。已有的病毒检测方法有两大类，一类是基于PCR技术的RT-PCR和荧光定量PCR技术；另一类是基于蛋白免疫反应的ELISA检测技术和斑点杂交检测技术。这些技术虽然都可用于田间介体昆虫带毒情况的检测，但均存在着一些不足，如检测成本高，技术要求高，检测耗时，不适合大批量样品检测等。因此在田间介体昆虫带毒率检测方面急需建立一种可大批量测定且直观快速的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测技术，可用于介体昆虫带毒率的大批量、快速检测。本发明可降低检测成本、缩短检测时间、提高检测灵敏度，可对田间采集到的大批量介体昆虫的带毒率进行检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，是通过对田间采集到的介体昆虫进行分类、解剖、固定、渗透、配制抗体标记液、抗体孵育、制片和观察，统计携带病毒的昆虫数，从而计算出介体昆虫的带毒率。

具体方法包括以下步骤：

1）昆虫分类：将田间收集到的介体昆虫按不同类别分类；

2）解剖：将活体昆虫装入玻璃试管，放在冰上使昆虫低温麻醉，麻醉后将昆虫取出，放在体视镜下用解剖镊解剖出昆虫的消化道器官；

3）固定：将获得的昆虫消化道器官放入装有200μl固定液的0.5 ml离心管中，静置60-90 min； 

4）渗透：固定后的消化道器官于pH值为7.2的0.01 mol/L PBS溶液中清洗两次，再放入200 μl渗透液中处理10-30 min；

5）配制抗体标记液：将荧光抗体与抗体稀释液按1:100混合于0.5 ml离心管中制得抗体标记液，并用锡箔纸包裹避光；每100头介体昆虫需50 μl抗体标记液；

6）抗体孵育：用pH值为7.2的0.01 mol/L PBS溶液清洗消化道器官两次，将清洗后的消化道器官放入荧光抗体标记液中，于37℃恒温孵育45-60 min；

7）制片：孵育结束后，再次用pH值为7.2的0.01mol/L PBS溶液清洗消化道器官两次；向洁净的载玻片上加入一滴抗衰减液，将清洗后的消化道器官摆放在抗衰减液中，盖上盖玻片；

8）观察：在荧光显微镜下观察并统计携带病毒的昆虫数，计算出介体昆虫带毒率。

步骤2）中解剖得到的消化道器官包括前憩室、食道、中肠和后肠。

步骤3）所述固定液为含质量分数为4%多聚甲醛的0.01 mol/L PBS缓冲液。

步骤4）所述渗透液是将0.2 ml TritonX-100溶液加入到10 mL 0.01 mol/L PBS缓冲液，充分搅拌混匀制得。

步骤5）中的荧光抗体是将不同病毒的抗体分别与不同激发光波长的荧光素交联制得；