[发明专利]一种测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法

权利要求书

1. 一种测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，其特征在于：通过对田间采集到的介体昆虫进行分类、解剖、固定、渗透、配制抗体标记液、抗体孵育、制片和观察，统计携带病毒的昆虫数，从而计算出介体昆虫的带毒率。

2. 根据权利要求1所述的测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，其特征在于：具体方法包括以下步骤：

1）昆虫分类：将田间收集到的介体昆虫按不同类别分类；

2）解剖：将活体昆虫装入玻璃试管，放在冰上使昆虫低温麻醉，麻醉后将昆虫取出，放在体视镜下用解剖镊解剖出昆虫的消化道器官；

3）固定：将获得的昆虫消化道器官放入装有200μl固定液的0.5 ml离心管中，静置60-90 min； 

4）渗透：固定后的消化道器官于pH值为7.2的0.01 mol/L PBS溶液中清洗两次，再放入200 μl渗透液中处理10-30 min；

5）配制抗体标记液：将荧光抗体与抗体稀释液按1:100混合于0.5 ml离心管中制得抗体标记液，并用锡箔纸包裹避光；每100头介体昆虫需50 μl抗体标记液；

6）抗体孵育：用pH值为7.2的0.01 mol/L PBS溶液清洗消化道器官两次，将清洗后的消化道器官放入荧光抗体标记液中，于37℃恒温孵育45-60 min；

7）制片：孵育结束后，再次用pH值为7.2的0.01mol/L PBS溶液清洗消化道器官两次；向洁净的载玻片上加入一滴抗衰减液，将清洗后的消化道器官摆放在抗衰减液中，盖上盖玻片；

8）观察：在荧光显微镜下观察并统计携带病毒的昆虫数，计算出介体昆虫带毒率。

3. 根据权利要求2所述的测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤2）中解剖得到的消化道器官包括前憩室、食道、中肠和后肠。

4. 根据权利要求2所述的测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤3）所述固定液为含质量分数为4%多聚甲醛的0.01 mol/L PBS缓冲液。

5. 根据权利要求2所述的测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤4）所述渗透液是将0.2 ml TritonX-100溶液加入到10 mL 0.01 mol/L PBS缓冲液，充分搅拌混匀制得。

6. 根据权利要求2所述的测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤5）中的荧光抗体是将不同病毒的抗体分别与不同激发光波长的荧光素交联制得；

所述抗体稀释液为含质量分数为3% BSA的0.01 mol/L PBS缓冲液；

每组抗体标记液中含有1种或1种以上不同病毒的抗体，根据不同的荧光信号能同时鉴定介体昆虫体内所携带的不同病毒。

7. 根据权利要求2所述的测定介体昆虫带毒率的免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤7）中的抗衰碱液是将甘油与0.01mol/L PBS缓冲液按体积比9:1混合后充分搅拌制得。