[发明专利]基于P-硝基苯丙氨酸插入法构建的骨质疏松疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及一种治疗骨质疏松症的药物，具体地说是基于P-硝基苯丙氨酸插入法构建的针对破骨细胞分化因子受体配体(RANKL)产生抗体的疫苗，本发明还涉及该药物的制备方法。

背景技术

骨质疏松症主要是一种表现为骨量的减少、骨骼微细结构的破坏，使得骨骼的承受力和强度降低，易于发生脆性骨折一类全身性骨代谢障碍疾病，也是多种骨破坏性疾病共有的病理损害。骨质疏松发病率高，且有逐年增高趋势。骨质疏松性骨折严重影响患者的生活质量，威胁患者的生命安全，同时也带来沉重的经济负担。目前治疗骨质疏松性疾病的药物包括钙剂、维生素D3、双膦酸盐等药物，每种治疗手段都有其局限性。比如，随着双磷酸盐类药物的广泛应用，其长期使用所引起的一些副作用(下颌骨坏死、食道炎以及最近报道的食道癌病例)也不容忽视。因此，仍迫切地需要探索更加有效、安全、简便和经济的治疗手段。

骨骼的强度和完整性，依赖于骨骼内骨吸收和骨形成之间的动态平衡，主要体现在对成骨细胞和破骨细胞之间数量和功能状态的精细调节。破骨细胞活动的过度增强是导致骨质疏松的主要病理机制。OPG/RANKL-RANK信号通路(OPG：骨保护素；RANKL：破骨细胞分化因子受体配体；RANK：破骨细胞分化因子受体)是机体控制破骨细胞分化成熟和功能的关键信号通路，通过阻断这一关键信号通路，可以抑制破骨细胞的分化和破骨活性，将实现对骨吸收作用的有效控制，以及对骨质疏松症等骨吸收性疾病的治疗。抗RANKL抗体可以特异性阻断RANKL与其受体的结合，从信号转导途径的上游有效地阻断破骨分化信号的发放，实现对骨质疏松的治疗。目前由美国Amgen公司研制的人源化抗RANKL抗体(商品名denosumab)治疗骨质疏松症的II期临床已经完成，安全性和疗效都得到充分的肯定，但是人源化抗体生产的高额成本使价格问题成为其市场化的一大障碍。

骨质疏松疫苗就是通过主动免疫手段，诱导机体产生针对RANKL的特异性中和抗体，实现对骨质疏松良好的治疗，同时克服或绕过工业化生产抗体的高额成本问题。目前，研制自体蛋白疫苗面临的一个共同技术挑战是如何克服机体对自体蛋白的免疫耐受。目前尚无能够克服机体对自体蛋白RANKL的免疫耐受，从而达到对骨质疏松产生治疗效果的疫苗。

发明内容

为了解决背景技术中所存在的问题，本发明提供了一种基于P-硝基苯丙氨酸插入法构建的骨质疏松疫苗，可以有效地克服自体蛋白RANKL的免疫耐受，从而实现对骨质疏松的治疗。

本发明采用的技术方案是：

(1)RANKL重组表达载体的构建。从骨髓基质细胞中提取RNA，通过RT-PCR扩增RANKL基因编码区，将胞外段克隆入表达载体，构建重组表达载体。

(2)非天然氨基酸p-硝基化苯丙氨酸编码序列的定点插入/置换。通过基于PCR的体外突变技术定点将RANKL基因编码酪氨酸或苯丙氨酸的密码子置换成能被非天然氨基酸p-硝基化苯丙氨酸反密码子特异识别的琥珀突变密码子TAG。也可突变其他位点，或增加突变位点，或不同突变组合的复合突变体。

(3)p-硝基化苯丙氨酸-RANKL蛋白的重组表达与纯化。在共转化表达琥珀突变抑制子tRNA(mutRNACUA)和p-硝基苯丙氨酸-tRNA合成酶的大肠杆菌内表达插入p-硝基化苯丙氨酸RANKL突变体，纯化重组蛋白。

(4)动物免疫与筛选。用纯化的蛋白皮下注射免疫雌性C57BL/6小鼠，通过ELISA检测血清中抗体的产生，并测定滴度。筛选出能够产生高滴度RANKL抗体的突变蛋白。

(5)基于血清中和检测及破骨细胞形成分析后的筛选。建立RANKL和RANK体外结合实验，通过竞争性结合分析检测RANKL突变体免疫小鼠的抗血清对RANKL和RANK结合的中和效应。选择能诱导小鼠产生高滴度、良好中和效应的p-硝基化苯丙氨酸RANKL突变体。大量表达和纯化重组蛋白，即可作为候选疫苗。

(6)动物实验：观察p-硝基苯丙氨酸-RANKL重组蛋白对骨质疏松的防治效果，挑选证实对骨质疏松有良好治疗效果的重组蛋白，大量表达纯化，作为骨质疏松疫苗。

该方法有效突破机体对自体蛋白的免疫耐受，通过主动免疫手段，诱导机体产生针对RANKL的特异性中和抗体，实现对骨质疏松良好的防治；同时克服或绕过工业化生产抗体的高额成本问题。

附图说明

图1是本发明基于P-硝基苯丙氨酸插入法构建骨质疏松疫苗的流程图

具体实施方式