[发明专利]一种PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶，包括对重组蛋白精氨酸脱亚胺酶（ADI）的PEG化修饰方法及其修饰产物的体内外活性研究，还包括PEG化修饰方法的优化，修饰酶的体内外稳定性和肿瘤治疗方面的研究应用，属于医药生物工程技术领域。

背景技术

精氨酸脱亚胺酶（arginine deiminase，EC 3.5.3.6，简称ADI）是一种极具潜力的用于治疗精氨酸缺陷型肿瘤的抗癌新药，包括目前尚缺乏有效药物的肝细胞瘤（hepatocellular carcinomas，简称HCCs）以及黑素瘤（melanomas）。正常细胞所需精氨酸可经体内的尿素循环由精氨琥珀酸合成酶（argininosuccinate synthetase，ASS）与精氨琥珀酸裂合酶（argininosuccinate lyase，ASL）共同作用催化瓜氨酸而生成。而精氨酸是生物体内合成绝大部分多肽及蛋白质的重要氨基酸。对于一些肿瘤细胞，因其缺少ASS而自身无法正常合成精氨酸，因此必须从外部环境中摄取精氨酸从而进行生长繁殖，这一类细胞被称之为精氨酸营养缺陷型肿瘤细胞，例如肝癌细胞和黑素瘤细胞。

肝细胞瘤是世界第五大人类常见癌症，全世界每年约有60万人死于肝细胞癌。在中国，肝癌死亡率位居肿瘤死因第2位。其高死亡率的原因在于HCC易转移、易复发、诊断不及时和治疗手段不彻底等。肝癌患者在确诊后没有经过治疗其生存期平均为1-4个月。通过手术治疗HCC效果不佳，且术后易复发，因此临床上迫切需要一种治疗肝癌的新方法。

ADI应用于癌症治疗最近二十年来为人们所广泛关注并接受。2002年，Ensor等发现在大肠杆菌中重组表达的支原体ADI对精氨酸营养缺陷型的23种人的黑素瘤以及16种人的肝细胞瘤在体外和体内都具有活性，通过对ADI进行聚乙二醇（PEG）化提高了ADI在体内的半衰期。2004年，他们将ADI-PEG-20用于肝癌的临床实验，结果成功使患者血浆中的精氨酸的可检测浓度降为零。目前，美国凤凰公司开发的支原体来源的ADI-PEG-20制剂用于肝细胞癌和黑素瘤（药品名称分别为Hepacid和Melanocid）的Ⅱ期和Ⅲ期临床试验正在全球多个中心进行。

本研究室通过筛选得到一株具有较高ADI活性的变形假单胞菌（P. plecoglossicida）CGMCC No.2039，对该ADI编码基因进行克隆和重组表达，并对重组ADI进行蛋白质工程改造以改善其酶活和酶学性质（包括Km和最适pH等），获得了多个更适合于生理中性条件的ADI突变株。为进一步解决ADI蛋白在体内半衰期短的问题，本发明对ADI突变株进行PEG修饰，以获得在体内具有更高稳定性和持久半衰期的ADI-PEG酶。

发明内容

本发明的目的是提供具有良好的抗肿瘤活性，延长半衰期的PEG修饰的精氨酸脱亚胺酶。主要针对精氨酸脱亚胺酶在体内半衰期短的问题，提供一种新的精氨酸脱亚胺酶修饰酶ADI-PEG。

本发明的技术方案：本发明所涉及的精氨酸脱亚胺酶为来源于变形假单胞菌（P. plecoglossicida）CGMCC No.2039，在中国专利200710107822.X “一株产精氨酸脱亚氨酶的菌种及其应用” 中已公开。精氨酸脱亚胺酶在大肠杆菌中进行重组表达。

一种PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶，采用PEG修饰剂修饰大肠杆菌中重组表达的精氨酸脱亚胺酶ADI突变株，得到PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶ADI-PEG；其中ADI突变株M314的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；ADI突变株M13的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；ADI突变株M13-1的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；ADI突变株M13-2的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；ADI突变株M13-3的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；ADI的基因全长1,254bp，编码417个氨基酸，单个ADI亚基的分子量为46.5 kDa，重组精氨酸脱亚胺酶由2个或4个相同的ADI亚基组成。

所述ADI-PEG为ADI亚基与5-15个PEG分子的共价结合物；分别命名为ADI-SS-PEG₂₀，ADI-SC-PEG₂₀，ADI-SPA-PEG₂₀；具有30%-70%的平均修饰率。