[发明专利]一种PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶，其特征在于：采用PEG修饰剂修饰大肠杆菌中重组表达的精氨酸脱亚胺酶ADI突变株，得到PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶ADI-PEG；其中ADI突变株M314的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；ADI突变株M13的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；ADI突变株M13-1的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；ADI突变株M13-2的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；ADI突变株M13-3的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；ADI的基因全长1,254bp，编码417个氨基酸，单个ADI亚基的分子量为46.5 kDa，重组精氨酸脱亚胺酶由2个或4个相同的ADI亚基组成。

2.根据权利要求1所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶，其特征在于：所述ADI-PEG为ADI亚基与5-15个PEG分子的共价结合物；分别命名为ADI-SS-PEG₂₀，ADI-SC-PEG₂₀，ADI-SPA-PEG₂₀；具有30%-70%的平均修饰率。

3.根据权利要求1所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶，其特征在于：所述PEG修饰剂为mPEG-SS_20 kDa，SS为琥珀酰亚胺琥珀酸酯；mPEG-SC_20 kDa，SC为琥珀酰亚胺碳酸酯；mPEG-SPA_20 kDa，SPA为琥珀酰亚胺丙酸酯；所述PEG修饰剂的平均分子量为20000 Da。

4.权利要求1所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶的制备方法，其特征在于步骤为：

（1）重组ADI粗酶液的制备：取重组表达精氨酸脱亚胺酶的大肠杆菌发酵液离心后收集菌体，用10-500mmol/L、pH 6-8的磷酸钠缓冲液洗涤2次，按湿菌体重量︰缓冲液重量比为1︰2-20加入缓冲液重悬，在冰浴条件下进行超声破碎15min，将破碎液离心，所得上清液即为重组ADI粗酶液；

（2）重组ADI的纯化：

a、HiTrap^TM DEAE FF阴离子交换层析：使用HiTrap^TM DEAE FF阴离子交换层析柱，平衡液为10-100mmol/L、pH 6.0-8.0 PBS缓冲液，洗脱液为10-100 mmol/L、pH 6.0-8.0磷酸钠缓冲液，其中含NaCl 0.1-1.0 mol/L；

洗脱采用线性梯度洗脱方法，NaCl初始浓度为0，终浓度0.1-1.0 mol/L；确定目的蛋白峰，收集蛋白样品；

b、Superdex^TM 200凝胶过滤层析：采用Superdex^TM 200凝胶预装柱进行纯化，使用10-100mmol/L、pH 6.0-8.0 PBS缓冲液，其中含NaCl 0.05-0.5 mol/L；

取步骤a所得蛋白样品上样500μL，洗脱1.0-3.0个柱体积，确定目的蛋白峰并收集，得到重组ADI纯酶液；

（3）PEG修饰反应：用10-50mmol/L PBS缓冲液调整步骤（2）所得重组ADI纯酶液浓度为0.1-1.0mg/mL、pH 6.0-10.0；按照摩尔比1︰30-120分别加入三种PEG修饰剂，即mPEG-SS_20 kDa，mPEG-SC_20 kDa，mPEG-SPA_20 kDa，于室温下搅拌反应1-4 h；将反应液加入100kDa的超滤管中，4000 r/min冷冻离心，每隔10 min加入10-100mmol/L PBS、pH 6.0-8.0进行滤洗，重复3-5次以除去游离PEG分子，即得产品PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶ADI-PEG。

5.权利要求1所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶的应用，其特征在于：所得到的ADI-SS-PEG₂₀，ADI-SC-PEG₂₀，ADI-SPA-PEG₂₀，与未修饰的ADI相比，修饰酶体外酶活稳定性良好，在小鼠血浆中稳定性显著提高。

6.根据权利要求5所述PEG修饰的重组精氨酸脱亚胺酶的应用，其特征在于：所述ADI-SPA-PEG₂₀在15 U的注射剂量下对H₂₂肝癌表现出95%以上的抑制率。