[发明专利]一种用于直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的快速免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明属于食品安全免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种用于直接检测呋喃它酮代谢物AMOZ的快速免疫检测方法。

背景技术

AMOZ是硝基呋喃类抗生素呋喃它酮的代谢物，是非法使用硝基呋喃类抗生素的指示物，是一类具有潜在致畸、致癌和致突变的物质。欧盟已于1995年禁止在食用动物中使用硝基呋喃类抗生素，又在1997年将所有的硝基呋喃类抗生素全部列为违禁药物，我国亦于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令。之后欧盟又于2003年通过了2003/181/EC委员会决议，建立了用于禽肉产品和水产品中硝基呋喃类药物代谢物的各种检测方法的最小要求性能限值为1μg/kg。现在，为保证食品安全，国内外的监管机构将注意力集中在了AMOZ的检测上，建立快速、简单、廉价、有效的AMOZ检测方法已刻不容缓。

    目前国内外检测AMOZ的方法主要有色谱方法及其联用技术、分光光度法、免疫分析法等。前两种属于仪器分析检测技术，存在着周期长、专业性强、费用高等不足，很难适应许多场合快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。而现在报道的基于抗原—抗体特异性结合检测AMOZ的免疫分析方法在检测之前均需对检测对象进行衍生化处理，存在着前处理操作复杂繁琐、成本高及回收率偏低等不足，限制了其应用。

    基于抗原-抗体识别的免疫分析技术在小分子化学性污染物检测领域占有重要地位，已经成功应用于农药、兽药、生物毒素等的快速检测，为保障食品安全发挥了重要作用。但是，大量实践证明：当化合物（半抗原）的分子量<300 Da时，其高特异性高亲和力的抗体制备难度增大。由于AMOZ分子量很小(201.22 Da)，即使将其与载体蛋白偶联，其高特异性高亲和力抗体的制备难度也相对很大，因此，目前关于AMOZ免疫分析检测技术的报道大都是需对其进行衍生化的间接检测，而关于直接检测AMOZ的免疫分析检测技术则鲜有报道。

    2009年，Pimpitak 等人报道了一种检测强化虾样品中AMOZ残留量的方法。他们将AMOZ与3-羧酸苯甲醛衍生化制备免疫半抗原CPAMOZ，通过抗原制备、动物免疫以及单克隆抗体制备获得单克隆抗体，该抗体虽然能够识别AMOZ，但是识别灵敏度低，比其对半抗原CPAMOZ的灵敏度低23倍。基于该抗体他们建立了间接检测AMOZ的免疫分析方法，即在检测前对其进行衍生化（将AMOZ与2-硝基苯甲醛衍生化为NPAMOZ），衍生化的时间需要十多个小时，十分费时。

    抗体是免疫分析的核心试剂，本课题组以一种新型的AMOZ半抗原，将其与载体蛋白偶联制备人工抗原，并进行抗体制备，获得了特异性识别AMOZ的抗体。同时为了提高对AMOZ分析的灵敏度，设计了一个与免疫半抗原不同结构的包被半抗原，基于此建立了一种异源免疫分析方法，该方法可以实现对AMOZ的直接检测，无需衍生化，同时只对AMOZ的原型呋喃它酮有交叉（CR=188.2%），与其它硝基呋喃类抗生素的原型及其衍生物无交叉现象，考虑到样品前处理采用水提的方式，呋喃它酮本身不能溶于水，对实际样品的检测影响不大，不会造成假阳性，可以用于实际样品的检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服传统的AMOZ免疫分析技术中均需对其进行衍生化处理的缺陷，提供一种AMOZ半抗原、人工抗原和高特异性抗体。

    本发明的第二个目的是提供所述AMOZ半抗原、人工抗原和特异性抗体的制备方法。

    本发明的第三个目的是提供一种可以对AMOZ进行直接快速检测的免疫分析方法。

    本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种AMOZ半抗原，所述AMOZ半抗原具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示分子结构：

 

所述AMOZ半抗原的制备方法为：将AMOZ和乙醛酸或顺丁烯二酸酐分别溶于无水乙醇中，搅拌过程中将乙醛酸或顺丁烯二酸酐的乙醇溶液滴加到AMOZ的乙醇溶液中，AMOZ和乙醛酸或顺丁烯二酸酐的摩尔比为1：1.2；室温搅拌过夜，反应结束，真空抽滤，依次用乙醇和乙醚洗涤2次，取沉淀、干燥获得式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示AMOZ半抗原。

一种AMOZ人工抗原，所述AMOZ人工抗原具有式（Ⅲ）或式（Ⅳ）所示分子结构：

 

优选地，本发明所述人工抗原的制备方法为：采用活泼酯偶联法将如上具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示分子结构的AMOZ半抗原与载体蛋白偶联制备得到具有式（Ⅲ）或式（Ⅳ）所示分子结构的AMOZ人工抗原。