[发明专利]一种DNA分子及毕赤酵母重组质粒和高效表达耐辐射球菌PprI蛋白的毕赤酵母重组菌

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA分子及毕赤酵母重组质粒和高效表达耐辐射球菌PprI蛋白的毕赤酵母重组菌。 

背景技术

在核事故、核恐怖以及核战争等核突发事件中，电离辐射可引起人体严重的急性放射损伤(acute radiation injury,ARI)。辐射损伤的救治与防护关系到原子能的和平利用与国家核安全，因此，该领域研究已成为世界各国政府和学者高度关注与重点投入的研究领域。 

耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans，DR）是迄今在地球上发现的辐射抗性最强的原核细菌，该菌极强的抗辐射能力与其本身具有完善而高效的DNA修复系统有关，多种DNA修复基因及其蛋白质对其特异的辐射抗性起着至关重要的作用。White等人于1999年首次公布了DR菌的基因序列，其中促DNA修复多效蛋白诱导因子(inducer of pleiotropic proteins promoting DNA repair，pprI)是耐辐射球菌中一种具有重要调控作用的辐射抗性基因，它含有987bp，编码328个AA，其产物PprI蛋白质是由DR_0167编码，分子量为37KD。近年研究表明，pprI基因是耐辐射球菌控制DNA修复和保护途径的总开关基因，耐辐射球菌受照后PprI蛋白通过多种信号通路调控210多种基因的上调表达，其中包括21中与DNA修复和复制相关的基因【H Lu,H Chen,G Xu,et al.DNA Repair,2012,11(2):139-145】。耐辐射球菌发现50余年来，世界各国学者对耐辐射球菌基因、蛋白质功能及其机理开展了深入细致的研究。然而，迄今为止，这些研究只局限于原核细胞内，即耐辐射球菌自身或大肠杆菌。 

申请号为200910003512.2的中国专利首次构建了一种耐辐射球菌pprI基因的真核表达重组质粒pCMV-HA-pprI，将其转入人胚肾293T 细胞和受照哺乳动物体内，成功表达了PprI蛋白质，对动物致死性急性放射损伤具有非常显著的防治作用，表明PprI蛋白质有望成为用于急性放射损伤防治的一种新的生物制剂。然而，该专利真核表达重组质粒pCMV-HA-pprI通过人体细胞工程目前尚难以获得高效大量表达和纯化的PprI蛋白质。 

应用原核表达系统大肠杆菌可高效表达和纯化PprI蛋白【张永芹,周辉,陈洁,杨占山.辐射研究与辐射工艺学报,2011,29(2):117-122.】，然而，该种技术存在许多缺陷：1.表达的蛋白质没有经过糖基化等翻译后修饰，导致活性降低；2.表达的蛋白质以包涵体形式存在，变性提取时也会导致蛋白质活性降低；3.大肠杆菌本身内毒素和有毒蛋白可混杂在目的蛋白产物中，导致应用受限。 

酵母是基因工程常用的真核表达系统之一，其中巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是以甲醇为唯一碳源的酵母工程菌的一种。该酵母具有如下优点，1.该酵母遗传操作简单，基因组高度稳定，可高水平表达外源基因；2.能进行蛋白质翻译后的修饰行为，如糖基化，二硫键形成，信号肽切除等；3.表达载体不含酵母复制原点，外源基因同源重组到酵母细胞染色体中稳定存在，整合后的外源基因随酵母的生长可稳定传代。 

如果能够通过真核表达系统毕赤酵母表达纯化耐辐射球菌PprI蛋白，那么现有技术中通过人体细胞或原核表达系统大肠杆菌表达纯化PprI蛋白的缺陷将会得到改善或解决。但是，耐辐射球菌属于原核生物，其与真核生物毕赤酵母在种系进化上存在巨大差异，例如基因和蛋白质组成与功能、蛋白质氨基酸密码子偏爱性等方面显著不同。所以，若直接将耐辐射球菌pprI基因通过基因工程构建到毕赤酵母表达系统中，预实验研究证实不可能并且也不利于高效表达耐辐射球菌PprI蛋白，按照本领域一般的基因改造技术很难成功解决这一难题。 

因此，本发明提供一种通过真核表达系统毕赤酵母成功表达纯化耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans R1）PprI蛋白的技术，为进一步研究该蛋白质的功能、机制和应用奠定了厚实的基础，填补了国际 辐射损伤和防护领域尚无原核抗放蛋白质的空白，使我国在辐射防护剂原创蛋白质药物的研究跻身国际先进行列。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种新合成的DNA分子，使得所述DNA分子能够通过巴斯德毕赤酵母成功高效表达和纯化PprI蛋白。 

此外，本发明还提供同样能够实现发明目的的包含所述DNA分子的重组质粒和高效表达耐辐射球菌PprI蛋白的毕赤酵母重组菌。