[发明专利]一种定点整合外源基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种定点整合外源基因的方法。

背景技术

溶菌酶是人乳中重要的抗菌因子，对大部分革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌均具有杀灭作用，对于增强婴幼儿免疫力有着重要的作用，同时溶菌酶在医疗保健，轻工业、食品业等方面也被广泛应用。2009年美国FDA批准了世界上首例乳腺生物反应器生产的抗凝血酶转基因药物上市，这标志着利用转基因动物生产重组蛋白真正迈入产业化阶段。

利用乳腺生物反应器生产重组蛋白具有广阔的市场应用前景，但是传统的转基因技术在乳腺生物反应器研究中仍存在一定的不足。传统的转基因研究中，由于外源基因在基因组中是一种随机插入，受到位置效应的影响以及载体自身大小限制，不能包含完整的调控元件往往使外源基因的表达量水平较低,甚至不表达或者异位表达(Clark,1994；Dobie1996；Kim,2007)。同时,由于外源基因的多拷贝随机插入到宿主基因组中,这种整合对宿主自身来说可能也存在一定风险（Seggewis,2006；McCormack,2004）。这些不利因素大大降低了转基因动物育种的可靠性，提高了成本，不利于转基因育种的发展。食品规范委员会和美国FDA颁布的转基因动物规范条例中也明确提出需充分重视这个问题。因此需要我们寻找使外源基因表达量更高，同时具有较高育种安全性和可靠性的新方法去改变传统的转基因育种。

为了提高外源基因的表达量，克服转入基因受到位置效应的影响，人们尝试了多种方法，如在载体中加入了核基质附着元件（MAR)、位点控制元件（LCR)、绝缘子（Insulator)等元件来克服外源基因表达受到位置效应的影响,但是由于基因表达调控的复杂性,仍不能取得很好的效果,而且外源基因在基因组上仍是随机插入,降低了转基因的可控性和安全性，这仍是在传统转基因研究急待解决的问题。基因打靶是基因靶向操作的一门转基因技术，利用外源基因与基因组序列间的同源性进行同源重组（homologous recombination）来实现定点对染色体进行修饰的一门技术，具有位点专一性强，可以稳定遗传以及外源基因不受位置效应影响，对邻近基因也没有影响等优点，将成为今后一种较理想的改造物种基因的操作方法。2000年K.J.McCreath利用基因打靶的方法将人抗胰蛋白酶基因（AAT）定点整合到羊原胶原基因座上（COL1A1），羊乳中人抗胰蛋白酶表达量为650μg/ml(McCreath,2000),远高于之前McClenaghan随机整合表达人抗胰蛋白酶的转基因羊乳中18μg/ml的表达量（McClenaghan，1991），克服了传统转基因受位置效应影响使蛋白低水平表达的弊端。

牛乳中酪蛋白含量占乳蛋白含量的76-86%，而且αs1、αs2、β、Κ是以基因簇的形式位于染色体中，研究发现存在一些类似LCR的序列来调控乳四种蛋白基因的协调表达(Curtin et al.1989;Rijnkels et al.2003)。

利用常规基因打靶进行转基因动物生产的效率很低，只有10^-6-10^-7的效率（Hanson K D et al.1995），而且最后得到的克隆动物通常会带有药物筛选所必须的抗性基因，最后要得到不含抗性基因的动物个体还要经历一次体细胞克隆。近年来，基于TALE结构的人工核酸内切酶已经被成功地应用于包括芽殖酵母、果蝇、斑马鱼、线虫、大鼠、水稻、蟋蟀、家蚕、非洲爪蟾与热带爪蟾、猪和牛、拟南芥在内的多个物种,以及体外培养的哺乳动物细胞(包括人类细胞)。类转录激活样因子效应物核酸酶(TALEN)技术被用来产生位点特异的双链断裂，当这一断裂通过具有同源臂的外源供体载体进行同源重组修复时，便可实现基因定点插入。

发明内容

本发明的目的是提供一种定点整合外源基因的方法。

本发明提供了一种定点整合外源基因到牛β-酪蛋白基因的第二外显子的方法，包括如下步骤：使TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ在离体的牛细胞中表达，得到第二外显子靶序列发生突变的细胞；同时将外源基因同源重组到靶序列位置，实现外源基因在牛β-酪蛋白基因的第二外显子上的定点整合；

所述TALE蛋白-Ⅰ的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述TALE蛋白-Ⅱ的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述靶序列如SEQ ID No.1所示；