[发明专利]一种定点整合外源基因的方法

权利要求书

1.一种定点整合外源基因到牛β-酪蛋白基因的第二外显子的方法，包括如下步骤：使TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ在离体的牛细胞中表达，得到第二外显子靶序列发生突变的细胞；同时将外源基因同源重组到靶序列位置，实现外源基因在牛β-酪蛋白基因的第二外显子上的定点整合；

所述TALE蛋白-Ⅰ的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述TALE蛋白-Ⅱ的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述靶序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述使TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ在牛细胞中表达的方法为将分别含有TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ编码基因的重组表达质粒导入牛细胞中；

所述含有TALE蛋白-Ⅰ编码基因的重组表达质粒具体为将SEQ ID No.2所示的DNA分子插入pCS2-FokⅠ骨架载体的NheⅠ位点得到；

所述含有TALE蛋白-Ⅱ编码基因的重组表达质粒具体为将SEQ ID No.3所示的DNA分子插入pCS2-Fok Ⅰ骨架载体的Nhe Ⅰ位点得到；

所述将外源基因同源重组到靶序列位置为将所述外源基因通过线性化的同源重组载体整合在靶序列位置上；

所述同源重组载体上具有靶序列同源左臂-外源基因-靶序列同源右臂的片段。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述同源重组载体的构建方法如下：将所述靶序列同源左臂序列插入pL452的KpnI和SalI位点间得到重组质粒，将其命名为L-pL452；再将所述靶序列同源右臂序列插入L-pL452的NotI和Sac Ⅱ位点间得到重组质粒，将其命名为L-pL452-R；最后将所述外源基因插入SalI和NotI位点间即得；

所述线性化为用限制性内切酶Sac Ⅱ线性化所述同源重组载体。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述同源重组载体是将所述外源基因插入SEQ ID No.15所示的DNA分子的SalI和NotI位点间得到；

所述靶序列同源左臂的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；

所述靶序列同源右臂的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述外源基因为人溶菌酶基因；

所述人溶菌酶基因如SEQ ID No.14所示；

所述靶序列同源左臂-外源基因-靶序列同源右臂的片段如SEQ ID No.16中自5’末端起第2654-10890位核苷酸所示；

所述同源重组载体的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述牛细胞为牛胎儿成纤维细胞。

7.一种试剂盒，该试剂盒由SEQ ID No.4所示的蛋白或SEQ ID No.4所示的蛋白的编码基因、SEQ ID No.5所示的蛋白或SEQ ID No.5所示的蛋白的编码基因、SEQ ID No.15所示的DNA分子组成；

或，

SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的蛋白；

或，

SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的蛋白的编码基因；

所述SEQ ID No.4所示的蛋白的编码基因具体如SEQ ID No.2中自5’末端起第4位至第1533位所示；

所述SEQ ID No.5所示的蛋白的编码基因具体如SEQ ID No.3中自5’末端起第4位至第1635位所示；

或，

含有SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的蛋白编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

或，

SEQ ID No.10所示的DNA分子；

和/或，

SEQ ID No.11所示的DNA分子。

8.SEQ ID No.15所示的DNA分子。

9.SEQ ID No.16所示的DNA分子。

10.SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的蛋白、SEQ ID No.10所示的DNA分子、SEQ ID No.11所示的DNA分子、SEQ ID No.15所示的DNA分子和/或SEQ ID No.16所示的DNA分子在将外源基因定点整合在牛β-酪蛋白基因的第二外显子上的应用；

所述外源基因具体为人溶菌酶基因；

或，

SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的蛋白、SEQ ID No.10所示的DNA分子、SEQ ID No.11所示的DNA分子、SEQ ID No.15所示的DNA分子和/或SEQ ID No.16所示的DNA分子在利用牛β-酪蛋白基因制备人溶菌酶中的应用；

或，

权利要求1-6任一所述的方法在制备人溶菌酶中的应用；

或，

权利要求7所述的试剂盒在制备人溶菌酶中的应用。