[发明专利]一种鉴定稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的多重PCR方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种鉴定稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的多重PCR方法，属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域，专用于含Pi-ta与Pi-b抗性基因水稻资源的鉴定和聚合育种研究。

二、背景技术

稻瘟病是由子囊菌(Magnaporthegrisea)引起的一种水稻真菌病害，其危害面积和程度之大已经对水稻高产、稳产造成了严重的阻碍。据统计，全球每年因稻瘟病损失的水稻产量约占总产量的10％～15％，足以供应6000万人1年的口粮（郑钊等,分子植物育种,2009,7(3):385-392），而我国的稻瘟病危害也相当严重，自上世纪90年代以来，我国稻瘟病的年发生面积均在380万hm²以上，年损失稻谷达数亿公斤（董继新等,农业生物技术学报,2000,8(1):99-102.）。实践证明，培育抗性品种是防治稻瘟病最经济、有效的方法。但由于稻瘟病菌变异性强，很多抗性品种种植几年就会丧失抗性（沈瑛等,植物病理学报,1993,23(4):309-313）。因此，利用分子标记辅助选择（Marker-assistedSelection，MAS）技术将多个具有不同抗谱的稻瘟病抗病基因聚合到同一个品种中，是培育具有持久抗瘟性品种的有效措施（HittalmaniS,etal.,TheorApplGenet,2000,100(7):1121-1128）。

随着分子生物学技术的迅速发展，迄今已有50多个主效抗稻瘟病基因被精细定位，其中24个基因被克隆（ZhaiC,etal.,NewPhytologist,2011,189(1):1-14;HayashiN,etal.,PlantJ,2010,64(3):498-510;OkuyamaY,etal.,PlantJ,2011,66(3):467-479;YuanB,etal.,TheorAppl Genet,20l1,122(5):1017-1028;TakahashiA,etal.,BMCPlantBiology,2010,10:175）。Pi-ta和Pi-b是最早被克隆的两个主效稻瘟病抗性基因。其中，Pi-ta是目前研究最广泛的稻瘟病抗性基因，该基因起源于籼稻，位于水稻第12染色体着丝点附近区域。Pi-ta与无毒基因AVR-Pita直接互作，并遵循基因对基因假说（BryanGT,etal.,PlantCell,2000,12(11):2033-2046）。Pi-b基因来源于水稻品种“BL1”，位于水稻第2染色体长臂近末端区域，与RFLP标记RZ123，C379，C2782B连锁，该基因对日本大多数稻瘟病菌生理小种具有抗性并受环境因素（如温度、光照等）的诱导和调控（WangZX,etal.,PlantJ,1999,19(1):55-64）。

为提高含稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b水稻资源鉴定和品种选育效率，许多研究者进行了大量的尝试，并相继开发了上述两个基因的抗、感位点的功能标记，用于稻瘟病抗性种质资源的筛选、鉴定。李进斌等利用特异性功能标记分析了云南地方稻种中抗性基因Pi-ta和Pi-b的等位性变异和分布（李进斌等,中国水稻科学,2012,26(5):593-599）；刘华招和时克等利用同样的分子标记分别对黑龙江水稻主推品种和我国主栽品种进行了Pi-ta和Pi-b基因型的鉴定和分析（刘华招等,东北农业大学学报,2011,42(41):27-31;时克等，植物遗传资源学报,2009,10(1):21-26）。这些研究侧重于利用标记分析Pi-ta和Pi-b抗性基因在不同水稻品种中的分布，很少涉及对上述标记进行检测方法的优化，同时对抗性基因Pi-ta和Pi-b进行基因型鉴定的分子标记方法目前尚未见报道。与单一基因分子标记的PCR方法相比，多重PCR在一次反应中就可对多个目标基因的等位性进行检测，具有效率高、成本低等优点，因而在品种资源鉴定和标记辅助育种中有着广阔的应用前景（MaW,etal.,Euphytica,2003,134(1):51-60;NakamuraT,etal.,Genome,2002,45(6):l150-l156）。