[发明专利]一种鉴定稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的多重PCR方法

权利要求书

1.一种鉴定稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的多重PCR方法，其特征在于：

利用PCR反应体系I中，

抗病等位基因Pi-ta特异性引物：

正向Pi-ta-F序列：5'-AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3'

反向Pi-ta-R序列：5'-CTACCAACAAGTTCATCAAA-3'

抗病等位基因Pi-b特异性引物：

正向Pi-b-F序列：5'-GAACAATGCCCAAACTTGAGA-3'

反向Pi-b-R序列：5'-TGGTCCACATGTCAGTGAGC-3'

和PCR反应体系Ⅱ中，

感病等位基因pi-ta特异性引物：

正向pi-ta-F序列：5'-AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT-3'

反向pi-ta-R序列：5'-CTACCAACAAGTTCATCAAA-3'

感病等位基因pi-b特异性引物：

正向pi-b-F序列：5'-TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT-3'

反向pi-b-R序列：5'-TGGAAGCGGATCCTAGGTCT-3'

同时扩增水稻品种的基因组DNA，如果体系I所用两对引物能同时扩增出1,042 bp和365 bp两条特征条带，即为含Pi-ta和Pi-b基因的纯合体；如果体系Ⅱ所用两对引物能同时扩增出1,042 bp和803 bp两条特征条带，即为含pi-ta与pi-b基因的纯合体；如果体系I和体系Ⅱ分别扩增出1,042 bp和803 bp的特征条带，则为含Pi-ta与pi-b基因的纯合个体；如果体系I和体系Ⅱ分别扩增出365 bp和1,042 bp，则为含pi-ta与Pi-b基因的纯合个体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

（1）水稻植株基因组DNA的提取；

（2）将权利要求1所述的稻瘟病抗病等位基因Pi-ta特异性引物与Pi-b特异性引物加入PCR反应体系I中，同时将权利要求1所述的感病等位基因pi-ta特异性引物与pi-b特异性引物加入PCR反应体系Ⅱ中，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；

（3）PCR反应体系I和Ⅱ中20 μL PCR反应体系包括：10 ng/μL的 DNA 2.0 μL，含25 mmol/L MgCl₂的10×PCR Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L的dNTP 0.4 μL，5 U/μL 的Taq0.5 μL，ddH₂O 13.1 μL和4 pmol/ μL的引物2.0 μL ：其中体系I中为引物Pi-ta-F、Pi-ta-R、Pi-b-F和Pi-b-R各0.5 μL，体系Ⅱ中为引物pi-ta-F、pi-ta-R、pi-b-F和pi-b-R各0.5 μL； 

（4）PCR反应体系I和Ⅱ中的程序包括：95℃预变性3 min；然后94℃变性1 min，55℃复性 1 min，72℃延伸1 min，6个循环；再进行94℃变性1 min，55℃复性50 s，72℃延伸30 s，32个循环，最后72℃延伸6 min，10℃冷却10 min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应；

（5）反应产物在质量比浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像。