[发明专利]检测体细胞核移植胚胎发育能力的引物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测体细胞核移植胚胎发育能力（Thy1基因的甲基化程度）的引物、试剂盒及方法，属于早期胚胎发育领域。

背景技术

近些年来，体细胞核移植技术得到迅猛发展和广泛应用，使良种动物的生产从基础研究迈进产业化，而产业化成功的关键就在于体细胞核移植胚胎的发育。目前，体细胞核移植胚胎发育水平比较低，制约着体细胞核移植胚胎的产业化发展，研究表明，这主要与体细胞核移植胚胎的重编程程度相关，其中组织特异性基因的持续表达是核移植胚胎发育失败的重要原因，而目前对核移植胚胎中组织特异性基因的甲基化没有相关报道，因此，明确组织特异性基因在体细胞核移植胚胎中甲基化模式，进而指导克隆胚胎的产业化是十分重要的。

现已证明，体细胞核移植胚胎重编程不完全导致组织特异性基因持续表达，其中Thy1基因是成纤维细胞的标记基因，在核移植胚胎中的沉默程度决定了胚胎的发育能力，因此检测Thy1基因在核移植胚胎中的甲基化程度可预测克隆胚胎的发育潜能。目前，对于基因甲基化区域的测定通常是采用预测法，直接将预测的区域作为该基因甲基化区域。然而研究表明，采用预测法获得的甲基化区域并不一定能代表该基因的甲基化水平，而且对于一些基因，并不能预测到甲基化区域，这就需要对Thy1基因的整个甲基化区域进行测序，并进一步明确Thy1基因甲基化区域，Thy1基因甲基化区域的明确将在体细胞核移植胚胎的生产和科学研究领域中具有实际应用价值。

发明内容

针对上述现有技术，本发明所要解决的技术问题是明确组织特异性基因Thy1甲基化区域，检测该区域在核移植胚胎中的甲基化程度，用以确定核移植胚胎的发育阶段及发育能力。本发明还根据该甲基化区域，提供了用于检测的引物、试剂盒及方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

检测体细胞核移植胚胎发育能力（检测Thy1基因甲基化程度）的引物对，如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.9所示；该引物对可以扩增Thy1基因的一段甲基化区域，该段的序列如SEQ ID NO.16所示。

上述引物对，可以用于制备检测体细胞核移植胚胎发育能力（检测Thy1基因甲基化程度）的试剂盒。

一种用于检测体细胞核移植胚胎发育能力的试剂盒（扩增并检测SEQ ID NO.16所示序列的试剂盒），包括SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.9所示的引物，以及PCR扩增反应所需要的常规试剂。比如：20μL扩增体系：10×PCR Buffer（Mg²⁺Plus）2μL，dNTP Mixture（各2.5mM）1.6μL，上游和下游引物（SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.9所示）各0.4μL（10μmol/L），模板5μL,Taq HS（5U/μL）0.1μL，ddH₂O12.5μL。

上述试剂盒可以用于检测体细胞核移植胚胎发育能力（检测Thy1基因的甲基化程度），具体应用时，步骤如下：

1）Proteinase K消化待测样品；

2）待测样品的亚硫酸氢盐处理；

3）以步骤2）处理后的基因组DNA为模板，利用前述扩增引物对（SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.9所示），进行热启动PCR扩增，得到PCR扩增产物；

4）对步骤3）获得的PCR产物进行测序，检测CpG位点的甲基化程度；根据CpG位点的甲基化程度评价体细胞核移植胚胎发育能力：甲基化程度为32%以下（不包括32%）时，体细胞核移植胚胎发育到囊胚的能力为32%以下；甲基化程度为32%～55%时，体细胞核移植胚胎发育到囊胚的能力为32%～55%；甲基化程度为55%以上（不包括55%）时，体细胞核移植胚胎发育到囊胚的能力为55%以上。

进一步地，检测某一阶段胚胎时，若甲基化程度为24.03～30.03%，则该胚胎发育到囊胚的概率为19.91%（接近实际比率21.37%）。更近一步地，检测核移植后36小时胚胎的甲基化程度，若为24.03～30.03%，则该胚胎发育到囊胚的概率为19.91%。

本发明的检测体细胞核移植胚胎发育能力的方法，可根据核移植胚胎各个发育阶段的检测结果，评价任一时期克隆胚胎发育阶段和发育能力。