[发明专利]室内培养获得小麦矮腥黑粉菌发病植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种室内培养获得小麦矮腥黑粉菌发病植株的方法，属于小麦矮腥黑粉菌防治领域。 

背景技术

小麦矮腥黑穗病是由小麦矮腥黑粉菌（Tilletia controversa Kühn，TCK)引起的重要国际检疫性病害，也是我国对外检疫的一类危险性植物病害。该病害危害大、防治难，一旦传入会给小麦生产带来毁灭性危害，通常发病率约等于小麦产量损失率。据Hoffmann报告，在流行年份，因TCK引起的损失率一般为20％～50％，最高可达75％～90％。除了产量损失外，被侵染的小麦出粉率也会随着感染严重程度而降低，并且因含有TCK冬孢子而极大地影响品质。目前该病害已在欧洲、北美、南美、大洋洲、亚洲、非洲等约49个国家发生。这些发病地点均在北纬30°和南纬30°以上的中纬度地区。TCK的寄主范围很广，危害小麦、大麦、黑麦等禾本科18个属的70多种植物，其中，对小麦危害最严重。小麦矮腥黑粉菌对我国的小麦生产存在潜在危机，该病在栽培条件下的主要寄主为冬小麦，我国常年小麦种植面积约2300万hm2，其中冬小麦占绝大部分，西北、黄淮海等广大冬麦区均适合小麦矮腥黑粉菌的定殖和发生危害，随着我国加入WTO及与TCK疫区国家-美国小麦贸易的增加，TCK传入我国的可能性日益增大，因此，必须加强对小麦矮腥黑粉菌生物学特性、发生危害规律和防控技术的研究，对小麦矮腥黑穗病进行早期预警及检疫检测，为病害防治提供技术储备。 

目前国内关于TCK冬孢子人工接种试验的相关研究较少，在大连、北京、天津等地室外采用将TCK冬孢子撒在土壤表面的接种方法得到了大量TCK病株，但在室外条件下进行研究时容易出现病菌扩散的情况，造成严重后果。由于在室内条件下不易培养发病植株，因此国内关于小麦矮腥黑粉菌完成侵染循环过程的研究受到限制，不能明确小麦矮腥黑穗病病害循环过程中各阶段的环境条件。 

发明内容

本发明提供了一种室内培养获得小麦矮腥黑粉菌发病植株的方法，可在室内成功获得TCK发病植株，以下概括本发明要求保护的内容： 

室内培养获得小麦矮腥黑粉菌发病植株的方法，包括完全在室内完成的如下步骤： 

（1）制备小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子： 

从小麦病穗中取菌瘿，进行表面消毒后制备成用于接种的小麦矮腥黑粉菌冬孢子悬浮液； 

将配制好的冬孢子悬浮液加入盛于培养皿中的培养基平板上，均匀涂抹，盖上培养皿盖并封口膜封好后倒置放于5℃的光照培养箱中培养，光照强度为600lx，培养15d之后开始镜检观察，以菌丝长到冬孢子直径的1/2时视为萌发，约70%的冬孢子萌发后用于小麦的人工接种； 

（2）制备用于接种矮腥黑粉菌的小麦种子： 

小麦种子表面消毒杀死种子表面可能携带的小麦矮腥黑粉菌和小麦网腥黑粉菌孢子，然后浸种催芽，胚芽鞘长度为1～3mm时用于接种萌发的冬孢子； 

（3）小麦的人工接种： 

在所述培养皿盖中铺上水润湿的滤纸，将步骤（2）制备的小麦种子铺放在所述滤纸上； 

将步骤（1）制备得到的承载有小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子的培养皿倒扣到铺放有小麦种子的所述培养皿盖中，使承载着小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子的一面与所述小麦种子接触，置于4-6℃的温度条件下进行春华处理直到苗长到3～5cm；将幼苗移入土壤中种植至植株成熟；（4）室内培养发病植株： 

将接种了小麦矮腥黑粉菌的幼苗种植到装有灭菌土壤塑料盆中，置于白天30℃，夜晚18℃的人工气候培养箱中，进行常规管理，定期观察小麦生长状况，将植株种植至成熟。 

步骤（1）中所述表面消毒的方法优选如下：从病穗中取1粒菌瘿，置于2mL离心管中，加入适量蒸馏水浸泡菌瘿，静置30min，然后将菌瘿捣碎并充分振荡，用150目网筛过滤后，将滤液放在室温下培养24h，低速离心后弃去上清液，加0.25%NaClO水溶液并在室温下放置1min，用灭菌水洗3次。 

步骤（2）中所述小麦种子表面消毒优选采用30%NaOCl水溶液浸泡5min，无菌水冲洗3次。 

步骤（4）中所述灭菌土壤，优选将营养土放入高压灭菌锅内，加热到60～100℃，持续30～60min。 

所述用于接种的小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子悬浮液的浓度优选为(50～130)×104个/mL。 

所述培养基指土壤浸提液培养基，配方为：1000mL培养基中含有20g琼脂、5mg80万IU青霉素、75g土壤。