[发明专利]一种检测胆固醇的酶生物传感器及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种检测胆固醇的酶生物传感器及其制备方法与应用。

背景技术

胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸、维生素D以及甾体激素的原料。但随着发展水平的提高，胆固醇异常的发病率呈增长趋势。现代研究已经发现，心脏病、糖尿病、动脉粥样硬化、静脉血栓、胆石症等与高胆固醇血症有密切的关系。因此胆固醇的快速测定方法具有重要意义。目前，临床检验中普遍采用的是以分光光度计为基础的酶比色法。但该方法用酶量大，所用仪器复杂，检测时间长，干扰因素多，不适合患者家中自测。因此，研发一种简单、方便、快速、准确、经济地测定胆固醇含量的方法是所趋之势。

近几十年来，酶生物传感器是有关研究人员研究的热点，也得到了迅速发展。但由于大多数酶的活性中心深埋在酶蛋白内部，再加上酶本身比较脆弱，易失活变性，电子隧道的距离等原因，都不易实现酶氧化还原中心与电极之间的电子传递。因此，目前发展的重心是寻找合适的载体、介体与酶的固定方法。研究人员已经尝试了各类修饰电极的载体、介体和酶的固定方法。胆固醇生物传感器的载体用的最多的是碳纳米管。［参考：（a）Yu-Chen Tsai，Siao-YunChen，Chen-An Lee.Sensors and Actuators B135（2008）96-101.（b）G.Li，J.M.Liao，G.Q.Hu，N.Z.Ma，P.J.Wu.Biosensors and Bioelectronics20（2005）2140-2144.（c）Xiaojun Cai,Xia Gao,Lisha Wang,Qi Wu,Xianfu Lin.Sensors and Actuators B181（2013）575-583.］。胆固醇生物传感器的介体为用普鲁士蓝和聚合物（比如聚苯胺），它们具有良好的导电能力，能提高酶与电极间的电子传递速率。［参考：（d）Xuecai Tan，Minjian Li，Peixiang Cai，Lijun Luo，Xiaoyong Zou.AnalyticalBiochemistry337（2005）111-120.（e）Suman Singh，Pratima R.Solanki，M.K.Pandey，B.D.Malhotra.Sensors and Actuators B115（2006）534-541.］。酶的固定多用具有良好成膜性和生物相容性的壳聚糖［参考：（f）Changzhi Zhao，Li Wan，Li Jiang，Qin Wang，Kui Jiao.Analytical Biochemistry383（2008）25-30.）］。除此之外，物理、化学性能优良的碳纳米材料石墨烯，有较大的比表面积，优良的导电性和载体特性，硫堇是被广泛应用的电子传介体，具有快速传递电子能力，都有被应用于葡萄糖、过氧化氢生物传感器的制备，但胆固醇生物传感方面的应用还尚未报道。

发明内容

为克服目前技术的不足及缺点，本发明的首要目的在于提供一种具有良好的选择性、灵敏度和稳定性的用于检测胆固醇的酶生物传感器；

本发明的另一目的在于提供上述酶生物传感器的制备方法；

本发明的再一目的在于提供上述酶生物传感器的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种检测胆固醇的酶生物传感器，由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，所述修饰后的工作电极由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别酶膜组成，其中，所述物质识别酶膜主要由石墨烯、硫堇、胆固醇氧化酶、辣根过氧化物酶及壳聚糖混合制备而成；

所述物质识别酶膜为将1～5mg/mL的石墨烯-壳聚糖溶液、5～10mmol/L的硫堇水溶液、20～30mg/mL的胆固醇氧化酶水溶液及10～20mg/mL的辣根过氧化物酶水溶液混合后干燥制得；

优选的，所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液、辣根过氧化物酶水溶液的体积比为1：1：1：1；

优选的，所述工作电极为玻碳电极，所述参比电极为饱和甘汞电极或Ag/AgCl参比电极，所述对电极为铂电极。

上述检测胆固醇的酶生物传感器的制备方法，包括如下步骤：首先将石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液混合均匀，得复合酶溶液；然后取复合酶溶液滴加到经表面预处理的工作电极的表面，晾干后得到修饰后的工作电极；将所述修饰后的工作电极、参比电极及对电极组成三电极体系，得到所述检测胆固醇的酶生物传感器。