[发明专利]一种检测胆固醇的酶生物传感器及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种检测胆固醇的酶生物传感器，由参比电极、对电极及修饰后的工作电极组成，所述修饰后的工作电极由工作电极及固化在工作电极表面的物质识别酶膜组成，其特征在于：所述物质识别酶膜主要由石墨烯、硫堇、胆固醇氧化酶、辣根过氧化物酶及壳聚糖混合制备而成。

2.根据权利要求1所述的检测胆固醇的酶生物传感器，其特征在于：所述物质识别酶膜为将1～5mg/mL的石墨烯-壳聚糖溶液、5～10mmol/L的硫堇水溶液、20～30mg/mL的胆固醇氧化酶水溶液及10～20mg/mL的辣根过氧化物酶水溶液混合后干燥制得。

3.根据权利要求2所述的检测胆固醇的酶生物传感器，其特征在于：所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液、辣根过氧化物酶水溶液的体积比为1：1：1：1。

4.根据权利要求1所述的检测胆固醇的酶生物传感器，其特征在于：所述工作电极为玻碳电极，所述参比电极为饱和甘汞电极或Ag/AgCl参比电极，所述对电极为铂电极。

5.一种根据权利要求1～4任一项所述的检测胆固醇的酶生物传感器的制备方法，其特征在于包括如下步骤：首先将石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液混合均匀，得复合酶溶液；然后取复合酶溶液滴加到经表面预处理的工作电极的表面，晾干后得到修饰后的工作电极；将所述修饰后的工作电极、参比电极及对电极组成三电极体系，得到所述检测胆固醇的酶生物传感器。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于具体步骤为：

（1）在1mL质量分数为0.5%～2%的壳聚糖醋酸溶液中加入1～5mg石墨烯，超声分散1～2h，得到石墨烯含量为1～5mg/mL的石墨烯-壳聚糖溶液；

（2）分别配制5～10mmol/L的硫堇水溶液、20～30mg/mL的胆固醇氧化酶水溶液及10～20mg/mL的辣根过氧化物酶水溶液；

（3）对工作电极进行表面预处理；

（4）将步骤（1）与步骤（2）中所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液及辣根过氧化物酶水溶液按比例混合均匀得复合酶溶液，取复合酶溶液3～5μL滴加到步骤（3）所述表面预处理后的工作电极的表面，室温晾干，得到修饰后的工作电极；

（5）将所述修饰后的工作电极与参比电极和对电极组成三电极体系，得到所述检测胆固醇的酶生物传感器。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤（1）所述的石墨烯的制备方法为：取5g鳞片石墨和2g NaNO₃进行混合，加入120mL浓硫酸，置于4℃的冰水浴中搅拌30min；然后加入20gKMnO₄，磁力搅拌反应60min，再移入40℃温水浴中继续反应30min；然后加入230mL蒸馏水，于95℃的温度条件搅拌5min，再加入质量分数为5%的双氧水，至不产生气泡，趁热过滤，并用去离子水和质量分数为5%的盐酸进行洗涤；然后透析一周，再在60℃真空干燥箱中干燥，得氧化石墨；称取0.1g所述氧化石墨溶解于50g蒸馏水中，超声60min，得到石墨分散液；加热所述石墨分散液至80℃并滴加2mL水合肼，反应4h后过滤，再用甲醇和蒸馏水冲洗，然后在60℃真空干燥箱中干燥，即得到石墨烯。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的表面预处理的具体操作为：首先将工作电极的表面依次用直径为0.3μm和0.05μm的Al₂O₃粉末抛光成镜面，再用水冲洗；然后依次在无水乙醇和水中分别超声清洗1min，取出用水洗净，晾干；然后将晾干的工作电极置于0.5mol/L的H₂SO₄溶液中进行电极活化。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的石墨烯-壳聚糖溶液、硫堇水溶液、胆固醇氧化酶水溶液、辣根过氧化物酶水溶液的体积比为1：1：1：1；步骤（4）及步骤（5）中所述工作电极为玻碳电极，所述参比电极为饱和甘汞电极或Ag/AgCl参比电极，所述对电极为铂电极。

10.根据权利要求1～4任一项所述的检测胆固醇的酶生物传感器在胆固醇定量检测中的应用。