[发明专利]一种内生枯草芽孢杆菌正突变株、制备方法和制备的生防菌剂及其防治石榴干腐病的应用

权利要求书

1.一种内生枯草芽孢杆菌正突变株，其特征是，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NS04307菌株，是一种防治石榴干腐病的生防菌，其特征在于该菌株为一株植物内生细菌正突变株，由分离自石榴叶片内部组织NS04菌株（已于2014年2月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 8812）经紫外线诱变选育得到，编号为：NS04307，已于2014年2月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 8813。

2.一种内生枯草芽孢杆菌正突变株的制备方法，其特征是：包括以下步骤：

（一）野生型内生菌株NS04的筛选

（1）内生菌株的分离和纯化

采集健康的石榴叶片称取3.0 g，自来水洗干净，用无菌水冲洗3次，无菌剪刀剪成4~5 mm见方的小块后，在超净工作台上，依次用75%的酒精浸泡5 s，0.1 %的升汞浸泡50 s，无菌水漂洗3次，然后加30 mL无菌水在无菌研钵中研磨；研磨后静止分层，上清液作为浸出液备用，其浓度为0.1 g/mL，取上清液1 mL进行梯度稀释至10^-5，从10^-3、10^-4、10^-5稀释悬液中各取0.2 mL涂布平板，以最后一次漂洗液0.2 mL涂布平板进行无菌检验，每处理3个重复；在37℃恒温培养箱中倒置培养24~48 h，挑取单菌落在牛肉膏蛋白胨平板培养基上采用平板划线法进行纯化；纯化后的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，37℃培养24 h，4℃冰箱保存备用；

（2）内生生防菌株的筛选

采用平板对峙法测定内生细菌对石榴干腐病菌( Zythia Versoniana Sacc.)的抑制作用；首先将石榴干腐病菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上28 ℃培养至产生孢子，用接种环挑取少量的病原菌孢子点接到马铃薯葡萄糖琼脂平板中央，在距平板中央3 cm的两条对称直线处划线接种已分离的内生细菌，以只接石榴干腐病菌为对照，每处理3个重复，28 ℃恒温培养箱中培养，待对照皿中病原菌菌丝即将铺满全皿时，计算抑制率的大小；

抑制率（％）＝[（对照菌落直径－处理菌落直径）／对照菌落直径]×100 ％，菌落直径单位：厘米（cm）；

通过石榴叶片内生菌的分离纯化和筛选，获得了一株对石榴干腐病菌有较好抑菌活性的内生菌菌株，抑制率为55.6%，编号为NS04；

（二）正突变菌株NS04307的制备

（4.1） 野生型菌株NS04生长曲线的测定

将活化后的出发菌株配成浓度为1×10⁸cfu/ml的菌悬液，取20 μl接入装有10 ml 牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中，共接18支，置于37 ℃，150 r/min摇床震荡培养，从2 h后开始，每隔2 h取出一支试管放进4 ℃冰箱保存，等全部取完后，用分光光度计在625 nm波长下分别测其OD值，以不接菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照，每个处理3个重复；. 以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制菌株生长曲线，确定其对数生长期；结果表明，NS04菌株的生长曲线呈S型，0~14 h为延滞期，对数生长期为16~24 h，26 h后进入稳定期，30 h后则进入衰亡期；7. 故选择培养20 h对数期的NS04菌悬液进行诱变处理；

（4.2）致死率曲线的测定及野生型菌株的诱变

将NS04菌株接种于100 mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃培养20 h，4 000 r/min离心10 min去上清，菌体用无菌生理盐水和0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 5.8)各洗涤一次后，调节菌液浓度约1×10⁸ cfu/mL；取33个培养皿，每皿加入5 mL上述菌悬液，每3个为1组，共11组；选用 20 W (照射距离30 cm)的紫外灯，预热30 min使波长稳定后，分别照射0 s、20 s、40 s、60 s、80s、100 s、120 s、140 s、160 s、180 s、200 s，然后每皿吸取0.1 mL涂平板，37 ℃恒温培养24 h，待平板上长出菌落后计数；以不经紫外线诱变的平板为对照，依据下列公式计算出每个处理的致死率，以照射时间为横坐标、致死率为纵坐标，绘制致死率曲线；

致死率(%) = [(对照组菌落数－紫外照射后菌落数) /对照组菌落数]×100%

采用紫外照射对细菌NS04进行诱变处理，在紫外灯功率和照射距离(保持30 cm)不变时，致死率仅与照射时间有关，且照射时间越长，诱变致死率越高；致死率在70%~80%时诱变效果较好；从致死率突变曲线可知，NS04菌株的诱变时间为260 s时致死率为75.87 %，选择260 s为NS04菌株最适诱变时间；

 (4.3) 突变菌株的筛选

采用琼脂块培养法进行突变株的筛选，采用平板对峙法检测突变株对石榴干腐病病原菌的抑菌活性；当石榴干腐病病原菌长满平皿时，用无菌接种环挑取石榴干腐病病原菌孢子，接在马铃薯葡萄糖琼脂平板中央，在其两侧3 cm处划线接种诱变菌株；在同样条件下接种出发菌株和只接石榴干腐病菌为对照，每处理3个重复，28 ℃培养7 d后测病原菌菌落直径，观察平板抑制作用，并计算突变菌株与出发菌株对病原菌的生长抑制率；

抑制率（％）＝[（对照菌落直径－处理菌落直径）／对照菌落直径]×100 ％，菌落直径单位：厘米（cm）；

经过筛选得到了正突变菌株NS04307，对石榴干腐病菌的平板抑制作用明显增强，其抑制率为80%，与出发菌株相比，抑制率提高了30.5%；

（4.4）正突变菌株NS04307的抑菌稳定性测定

将NS04307菌株在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上传代，共传10次，并在相同条件下对每一代的菌株做平板对峙实验，NS04307的抑菌率在71.95%~80.00%，该菌株对石榴干腐病的抑制率保持稳定，说明NS04307突变菌株对石榴干腐病菌的抑制作用能稳定遗传。