[发明专利]一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法。

背景技术

近年来，随着鹅产业的快速发展，鹅产蛋性能较低（一般年产蛋量仅为40~90枚）已成为制约鹅产业化发展的重要因素，是鹅产业亟待解决的关键问题之一。鹅产蛋性能主要取决于卵巢中卵泡的生长和发育水平，并受品种、环境和饲养管理等因素的影响。鹅卵泡经过发育、选择和闭锁等机制建立起严格的等级体系，原始卵泡经等级前发育进入小黄卵泡库，随后被选择并进入等级发育。家禽可通过调控起始发育卵泡的数量和小卵泡（白卵泡和小黄卵泡）闭锁来调节卵巢的功能，同时还可通过闭锁机制清除排卵前卵泡来调节排卵的速率，进而影响家禽的产蛋性能。

卵巢颗粒细胞是动物生殖过程中非常重要的一类细胞，在动物体内，颗粒细胞的增殖分泌功能与卵母细胞的生长和成熟紧密相关。从原始卵泡发到卵泡成熟排卵，颗粒细胞作为主要的功能细胞，其增殖与分化直接影响到卵巢功能。原始卵泡发育完成后，颗粒细胞表达雌激素受体和促性腺激素释放激素受体，成为对激素具有应答能力的初级卵泡，之后依次发育成为等级卵泡。在体外，颗粒细胞能直接影响卵巢卵母细胞的发育，而颗粒细胞的凋亡则直接导致卵泡的闭锁。因此，作为卵泡体细胞的颗粒细胞，通过细胞间的相互作用，对卵泡膜细胞和卵母细胞的发育、成熟及其功能起重要的调控作用，进而影响卵泡的启动、发育、成熟及闭锁的全过程。随着动物卵泡闭锁中颗粒细胞凋亡的发现，颗粒细胞在卵泡发育中的作用开始被人们重视。因此，探寻一种鹅卵泡颗粒细胞体外培养的方法，对颗粒细胞进行深入的研究，对于阐明颗粒细胞在鹅卵泡发育过程中所发挥的生物学功能以及调控机理具有重要的理论意义和实际意义。

发明内容

本发明提供一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法，本发明解决了目前尚未有完善的鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞分离培养方法的问题。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法，其操作步骤是。

（1）将健康的产蛋期四川白鹅母鹅颈部放血处死，用75 %酒精棉擦拭干净后剪开腹部皮肤取出卵巢及卵泡，再用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, PBS）冲去血污，将干净的卵巢卵泡放入装有PBS的500 mL烧杯中，迅速拿入细胞培养室中。

（2）将较大的等级卵泡及小黄卵泡取出，剥净外层的结缔组织和血管网，在装有PBS的500 mL烧杯中洗净血污放入装有PBS的培养皿中。

（3）将剥离好的卵泡，在卵泡柄对面的无血管区切开，稍微用力挤出卵黄，颗粒细胞层会被卵黄带出并停留在卵黄表面，再用镊子小心夹出后放入新的装有PBS溶液的培养皿中。

（4）将初次分离的颗粒细胞放在37 ℃预热的装有PBS的培养皿中清洗5次，洗净卵黄。

（5）将清洗后的颗粒细胞置于50 mL的小烧杯中并加入有2 mL胶原蛋白酶，用眼科剪剪成小块组织（机械分离持续5 min），再将其封口后，置于37℃水浴消化4 min。

（6）向消化完全的颗粒细胞加入适量胎牛血清，终止消化。

（7）将消化后的颗粒细胞用不锈钢过滤网过滤，并用少量细胞培养液冲洗过滤网，将过滤后的颗粒细胞分装在50 mL的离心管中封口1000 rmp离心10 min，弃上清，再加入培养缓冲液悬浮细胞，重复此过程一次。

（8）加入含有胎牛血清的改良杜氏伊格尔培养基（dulbecco's modified eagle medium, DMEM）培养液吹打细胞是细胞悬浮，稀释细胞时细胞密度维持在1×10⁶个，将稀释后的细胞悬液分装在6孔板进行培养，每孔2 mL。

（9）用75 %的酒精棉将培养板擦拭干净后，置于培养箱恒温培养，培养箱条件为37 ℃，5 %的CO₂。

上述步骤中所述PBS溶液是：在500 mL去离子水中依次加入8 g的NaCl，0.2 g的KCl，1.56 g的Na₂HPO₄·2H₂O，0.2 g的KH₂PO₄，溶解后用1 mol/L的NaOH调节PH值至7.2~7.4，用去离子水定容至1 L，高温高压（121 ℃，100 kpa）灭菌30 min。

上述步骤中所述胶原蛋白酶是：100 mg的胶原蛋白酶稀释于100 mL的水中，其终浓度为1 mg/mL。

上述步骤中所述不锈钢过滤网是：200目不锈钢过滤网。