[发明专利]一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞培养的方法，其特征在于，其操作步骤为：

（1）将健康的产蛋期四川白鹅母鹅颈部放血处死，用75 %酒精棉擦拭干净后剪开腹部皮肤取出卵巢及卵泡，再用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, PBS）冲去血污，将干净的卵巢卵泡放入装有PBS的500 mL烧杯中，迅速转移至细胞培养室中；

（2）将较大的等级卵泡及小黄卵泡取出，剥净外层的结缔组织和血管网，在装有PBS的500 mL烧杯中洗净血污后，置于含有PBS的培养皿中；

（3）将剥离好的卵泡，在卵泡柄对面的无血管区切开，稍微用力挤出卵黄成分，颗粒细胞层会被卵黄带出并停留在卵黄表面，再用镊子小心夹出后放入新的装有PBS溶液的培养皿中；

（4）将初次分离的颗粒细胞置于37 ℃预热的PBS培养皿中清洗5次，洗净卵黄；

（5）将清洗后的颗粒细胞置于50 mL的小烧杯中并加入2 mL胶原蛋白酶，用眼科剪剪成小块组织（机械分离持续5 min），再将其封口后，置于37 ℃水浴消化4 min；

（6）向消化完全的颗粒细胞中加入适量胎牛血清，终止消化；

（7）将消化后的颗粒细胞用不锈钢过滤网过滤，并用少量细胞培养液冲洗过滤网，将过滤后的颗粒细胞分装在50 mL的离心管中封口1000 rmp离心10 min，弃上清，再加入培养缓冲液悬浮细胞，重复此过程一次；

（8）加入含有胎牛血清的改良杜氏伊格尔培养基（dulbecco's modified eagle medium, DMEM）培养液吹打细胞使细胞悬浮，稀释细胞时细胞密度维持在1×10⁶个，将稀释后的细胞悬液分装在6孔板进行培养，每孔2 mL；

（9）用75 %的酒精棉将培养板擦拭干净后，置于培养箱恒温培养，培养箱条件为37 ℃，5 %的CO₂。

2.根据权利要求1所述的鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞分离培养方法，其特征在于，上述步骤中所述PBS缓冲液是：在500 mL去离子水中依次加入8 g的NaCl，0.2 g的KCl，1.56 g的Na₂HPO₄·2H₂O，0.2 g的KH₂PO₄，溶解后用1 mol/L的NaOH调节PH值至7.2~7.4，用去离子水定容至1 L，高温高压（121 ℃，100 kpa）灭菌30 min。

3.根据权利要求1所述鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法，其特征在于，上述步骤中所述的含胎牛血清的培养基是：含3 %胎牛血清的DMEM。

4.根据权利要求1所述鹅卵巢卵泡原代颗粒细胞的分离培养方法，其特征在于，上述步骤中所述的胶原蛋白酶是：100 mg的胶原蛋白酶稀释于100 mL的水中，其终浓度为1 mg/mL。